背景和创新性
HEK293 细胞瞬时转染原先主要用于蛋白表达，以供研究和发现目的使用。最近，该技术在基因治疗应用中获得了广泛关注，并在这方面的应用中成为病毒载体生产的主力军。许多因素可能影响重组蛋白或病毒载体的生成，而细胞培养基在工艺运行时间、生产率和产品质量方面发挥着关键作用。
本文我们重点探讨支持高细胞生长速率和转染效率的 HEK293 瞬时转染原型培养基的开发。
实验方法
研究工作流程概述
首先根据达到的峰值活细胞密度 (VCD) 和转染效率对先前开发的两种 HyClone™ HEK293 转染培养基原型的性能进行了评估。使用市售 HEK293 细胞系进行转染。
在前两种原型的基础上，在实验设计 (DoE) 中使用混合物设计进一步开发了新的转染培养基原型 293PT。对 293PT 进行了进一步分析，以确定有效组分。
最后，使用三种 HEK293 细胞系评价了 293PT 的初步性能，并与三种市售转染培养基进行了比较。从这项研究中得出的结论将有助于未来的优化和开发。
转染检测方法
本研究中进行的转染实验均先将表达 GFP 的质粒与 Polyplus PEIpro®（转染剂）混合，然后将复合物递送至细胞培养物中。在转染后 72 小时内通过流式细胞仪 BD FACSCelesta™ 测量并计算转染效率。
图 1. 新转染培养基 293PT 的开发工作流程概述。
结果
新原型探索：混合物 DoE 设计
首先根据细胞生长和转染效率评估两种 HyClone™ HEK293 转染培养基原型的性能（图 2）。采用混合物 DoE 设计开发下一代转染培养基原型（图 3）。观察到了浓度依赖性效应：混合物中原型 2 的百分比越高，转染效率越低。
图 2. 评估了两种 HyClone™ HEK293 转染培养基原型的峰值活细胞密度（左）和最大转染效率（右）。这两种原型表现出相反的性能。
图 3. 采用混合物 DoE 设计开发了一种新原型。结果显示出浓度依赖性效应：混合物中原型 2 的百分比越高，转染效率越低。
293PT 开发：关键组分研究
进一步鉴定并检测了原型 2 中的关键组分 “X”，以证明其在转染培养基中的作用（图 4）。虽然高浓度的“X”可以支持细胞生长，但对转染效率却有不利影响。据我们所知，之前未报告“X”在高浓度下会影响转染效率的问题。进一步评估“X”的工作浓度，然后开发了原型 293PT（图 5）。
图 4. 对关键组分“X”进行鉴定，并研究了其对转染效率和生长的影响。虽然高浓度 “X”支持细胞生长，但对转染效率却有不利影响。
图 5. 探索了 “X”的工作浓度以用于开发 293PT。研究了三种浓度的 “X”。选择了浓度1 并建立新培养基原型 293PT 以用于进一步评估。
293PT 初步性能
首先使用三种不同的 HEK293 细胞系评估 293PT 的性能，并与来自不同供应商的三种市售转染培养基进行比较（图 6）。
不同培养基对于 HEK293 细胞系的培养性能有所不同。与其他市售培养基相比，293PT 可以普遍支持细胞生长并表现出具有竞争性的转染效率。
本研究中使用的市售培养基：
- 市售培养基1：Expi293™ 表达培养基 (Thermo Fisher Scientific)
- 市售培养基2：OPM-293 CD03 培养基 (OPM Biosciences)
- 市售培养基3：BalanCD™ HEK293 (Fujifilm Irvine Scientific)
本研究中使用的 HEK293 细胞系：
- 细胞系 1：Freestyle™ 293-F (Thermo Fisher Scientific)
- 细胞系 2：Expi293F™ (Thermo Fisher Scientific)
- 细胞系 3：HEK-293.2sus (ATCC)
图 6. 使用三种不同 HEK293 细胞系对 293PT 与三种市售 HEK293 转染培养基进行综合比较*。有关使用的市售培养基和细胞系的标识，请参见正文。
*所有研究均在 37°C、5% CO2、80% 湿度和 120 RPM（摇动直径 25 mm）条件下进行。
未来发展方向
初步性能评估证实了 293PT 的潜力。然而，需要进一步优化以开发下一代 HEK293 转染培养基。此外，需要证明培养基支持瞬时转染和基因治疗产品的生产。
总结
我们开发了一种新 HEK293 转染培养基原型 293PT，用于未来的瞬时蛋白表达和基因治疗应用。主要发现：
- 本研究鉴定了关键组分 “X”及其对细胞生长和转染效率的影响。虽然高浓度的“X”可以支持细胞生长，但对转染效率却有不利影响。据我们所知，这些影响以前尚未报告过。
- 293PT 与市售 HEK293 转染培养基在不同细胞系中的综合比较说明了当前原型的优点和缺点。