利用在线稀释高效制备层析缓冲液

典型的生物工艺工作流程需要大量的缓冲液和过程液体，因而缓冲液制备是生物制造设施中资源最密集的活动之一。

本文我们讨论 ÄKTA process™ 层析系统中在线稀释 (ILD) 技术的精度和性能。我们还比较 ILD 与缓冲液手动制备（该方法仍然是最常用的缓冲液制备方法）的工艺经济性，对比每种方法的工时、缓冲液体积、占用空间大小和所需投入。

简介：在线稀释及其优势总结

ILD 使用缓冲液浓缩液减少缓冲液体积，然后使用注射用水 (WFI) 在线稀释以达到最终的目标缓冲液浓度（图 1）。具有层析和 ILD 功能的系统由于批量较小，缓冲液制备可以直接整合到层析过程中，从而无需在缓冲袋或储罐中进行中间储存。缓冲液浓缩液可以在内部制备，也可以外包制备。

ILD 可以显著减少时间、人力和空间需求，而不会影响缓冲液质量或一致性。为了成功实现这一目的，ILD 需要使用精确的传感器和流速范围宽的泵。

图 1. ILD 使用缓冲液浓缩液减少缓冲液体积，然后使用注射用水在线稀释。

具有在线稀释功能的 ÄKTA process™ 层析系统

自动化 ÄKTA process™ 液相层析系统的构造适合工艺放大和大规模生物制药生产。它有三种不同的流速范围，从 1 L/h 到 2000 L/h，流路由电解抛光不锈钢或聚丙烯制成（表 1）。该系统提供 GMP 监管环境所需的精度和文档，是小型 ÄKTA™ 层析系统开发放大和转移工艺的良好选择。

ÄKTA process™ 层析系统提供灵活的设计，可以轻松配置以满足不同的工艺需求，包括可以选择添加第三台泵以支持 ILD 缓冲液制备（图 2）。ÄKTA process™ 层析系统配备 ILD，可以在使用点制备和购置缓冲液，从而节省空间、时间和成本。

图 2. ÄKTA process™ 层析系统配备第三台泵以支持在线稀释 (ILD)。

表 1. ÄKTA process™ 系统的最大流速和最大操作压力

1 bar = 0.1 MPa = 14.5 psi

使用 ÄKTA process™ 系统进行在线稀释

为使 ÄKTA process™ 层析系统支持 ILD，可使用第三台泵稀释来自 A 和 B 泵的缓冲液浓缩液。用户可以设置第三台泵的稀释系数，范围为 1 到 100 倍。然后，第三台泵将来自 A 和 B 泵的缓冲液稀释至设定的稀释系数。此过程也可以由管理，例如: ÄKTA process™ 层析系统可以通过配置第三台泵稀释来自A 和 B 泵的缓冲液浓缩液，来实现ILD功能。用户可以在UNICORN控制系统上设置第三台泵从1到100倍范围内的稀释系数，从而控制稀释过程达到指定的浓度。这一控制过程也可以通过其他控制系统 ，例如DeltaV™ 分布式控制系统 (DCS)来管理。

溶液梯度的精度取决于梯度反馈控制信号的精度，因此在精确配置缓冲液浓缩液的前提下，ILD 的实际梯度取决于流量计的精度。

图 3. 配备 UNICORN™ 软件的 ÄKTA process™ 层析系统提供交互式流程图。也可以通过该软件查看和控制 ILD 功能。

精度和性能

流量精度的指定

流量精度可以指定为满量程的百分比 (% FS) 或读数的百分比 (% RD)，或两者结合。如果仪器的流量精度指定为 % FS，则与流速无关，误差均为固定值。例如，如果满量程流速为 1000 L/h，并且系统的精度为 2% FS，则在所有流速下偏差都将为 ± 20 L/h。这意味着在流速为 100 L/h 时，偏差也将为 ± 20 L/h（或与读数值相差 ± 20%）。

相反，如果系统将流量精度指定为 % RD，则误差将始终与读取值的百分比相同。在这种情况下，如果系统精度为 2% RD，则流速在 1000 L/h 时偏差为 ± 20 L/h，流速在 100 L/h 时偏差仅为 ± 2 L/h。

梯度精度和可接受梯度范围的指定

梯度是指由不同泵输送的两种或更多种溶液在某个混合点混合成一种溶液。梯度可分为两种：线性梯度和阶梯梯度。梯度精度通常用可接受梯度范围表示，在可接受的范围内定义精度。可接受梯度范围以系统流速范围内缓冲液 B 的百分比 (% B) 表示。

可接受梯度范围根据产生梯度的每个泵的流量精度确定。其中一台泵从线性梯度开始至结束（0% 到 100%）的过程中达到最小流速。随着流速下降，当一台泵的流速较低时，% B 高的区域和低区域的可接受范围变窄。当超出可接受范围时，随着流速降低，% B 高的区域和低区域的精度逐渐降低。梯度精度定义为在可接受范围内与 % B 的偏差。

结果

具有 ILD 功能的 ÄKTA process™ 系统的流量精度

使用流速反馈时，具有 ILD 功能的 ÄKTA process™ 1 英寸系统的流速精度为 ± 1% RD 或 1 L/h，以最大者为准；较小系统的流速精度为 ± 1% RD 或 0.1 L/h，以最大者为准。（表 2）

表 2. ÄKTA process™ 系统的流速精度

具有 ILD 功能的 ÄKTA process™ 系统的梯度精度

具有 ILD 功能的 ÄKTA process™ 系统在可接受梯度范围内的梯度控制精度为 ± 2% B。为测试该精度，我们在三种不同稀释系数和三种不同流速下对所有三种系统尺寸进行了测量。图 4 至图 6 显示了三种系统尺寸的测量点的可接受梯度范围。

控制精度是指理论梯度与梯度反馈控制信号之间的偏差。在流速模式下，控制精度是指流量计测量的流速；在电导率控制模式下，控制精度是指柱前电导率监测器读取的电导率。因此，实际梯度取决于电导率监测器等的校准精度。

在低流速或高稀释系数下，整个梯度范围（0% 到 100% B）自始至终超出可接受范围，此时精度不佳。超出可接受范围后，随着流速的降低，在 % B 高的区域和低区域或稀释系数较高时，精度逐渐降低，建议使用阶梯梯度或在可接受范围内的较窄的线性梯度。

图 4. 具有 ILD 功能的 6 mm ÄKTA process™ 系统在不同稀释系数（10、20、30、40、50、60、70、80）下的流速范围内的可接受梯度范围（以 % B 表示）。可接受范围内的梯度控制精度为 ± 2% B。稀释系数为 10、20 和 40 的曲线上的点表示在特定流速下测量的最小和最大梯度组成，表 3 中对此也有描述。

表 3. 具有 ILD 功能的 6 mm ÄKTA process™ 系统在给定流速和稀释系数下测得的梯度组成（在图 4 中以点表示）

图 5. 具有 ILD 功能的 10 mm ÄKTA process™ 系统在不同稀释系数（10、20、30、40、50、60、70、80、90）下的流速范围内的可接受梯度范围（以 % B 表示）。可接受范围内的梯度控制精度为 ± 2% B。稀释系数为 10、20 和 40 的曲线上的点表示在特定流速下测量的最小和最大梯度组成，表 4 中对此也有描述。

表 4. 具有 ILD 功能的 10 mm ÄKTA process™ 系统在给定流速和稀释系数下测得的梯度组成（在图 5 中以点表示）

图 6. 具有 ILD 功能的 1 英寸 ÄKTA process™ 系统在不同稀释系数（10、20、30、40、50、60、70、80、90）下的流速范围内的梯度可接受范围（以 % B 表示）。可接受范围内的梯度控制精度为 ± 2% B。稀释系数为 10、20 和 40 的曲线上的点表示在特定流速下测量的最小和最大梯度组成，表 5 中对此也有描述。

表 5. 具有 ILD 功能的 1 英寸 ÄKTA process™ 系统在给定流速和稀释系数下测得的梯度组成（在图 6 中以点表示）

ILD 与手动缓冲液制备之间的工艺经济性比较

本文我们深入探讨使用内部配制或外购的缓冲液浓缩液（如 HyClone™ 缓冲液浓缩液）对比手动制备缓冲液与使用 ILD 制备缓冲液的工艺经济性差异（图 7）。我们将比较这三种缓冲液制备策略的工时、处理体积、占用的最小空间和所需的资本投入。

按照每年使用 40 个批次的典型三步单克隆抗体 (mAb) 工艺进行计算，每个批次需要 15000 L 缓冲液。

所有工艺经济性计算仅供参考，并根据 2021 年的数据。该计算根据 Cytiva 内部总拥有的成本工具得出。

图 7. 手动制备缓冲液 (I)、使用内部制备的缓冲液浓缩液通过 ILD 制备缓冲液 (II)、使用外购的缓冲液浓缩液通过 ILD 制备缓冲液 (III) 的缓冲液制备工作流程。

工艺经济性计算

在考虑制备每个批次缓冲液所需的时间和人力时，手动制备与 ILD 之间的差异是显著的，尤其是当 ILD 与外购缓冲液浓缩液结合使用时。手动制备一批 15000 L 的缓冲液需要近 400 小时，使用内部制备的缓冲液浓缩液的 ILD 需要 300 多个小时，而使用外购缓冲液的 ILD 需要不到 20 小时。

在比较累计成本（包括 10 年的资本投入、运营成本和折旧）时，我们的计算估计值表明，与手动缓冲液制备相比，10 年后使用手动制备缓冲液浓缩液的 ILD 的成本效益高约 15%，使用外购缓冲液浓缩液的 ILD 的成本效益高约 40%。事实上，ILD 的经济优势在仅仅第一年之后就已经很明显。在我们比较的方法中，长期来看使用外购缓冲液浓缩液的 ILD 是最经济的选择，因为可以完全省去初级制备和初级存放步骤。

图 8. 手动制备缓冲液 (I)、使用内部制备的缓冲液浓缩液通过 ILD 制备缓冲液 (II) 使用外购的缓冲液浓缩液通过 ILD 制备缓冲液 (III) 的缓冲液制备工作流程。

此外，尽管无论使用哪一种制备方法每个批次使用的缓冲液总体积均相同，但手动缓冲液制备与 ILD 相比需要在层析系统之外处理和移动的缓冲液体积存在显著差异。手动缓冲液制备需要管理超过 33000 L 的缓冲液。由于只需要管理和移动浓缩液，ILD 管理的缓冲液体积则显著降低。使用内部制备的浓缩液进行 ILD 时，需要处理的缓冲液体积约为 7200 L。使用外购缓冲液浓缩液进行 ILD 时，仅需处理约 3500 L 的缓冲液。

图 9. 每种缓冲液制备方法每个批次处理的缓冲液体积。

这三种方法相比较，制备缓冲液的占用空间也存在很大差异。由于在层析系统外部管理的缓冲液体积很大，手动缓冲液制备需要约 120 m² 的空间，其中加工套间需要接近 52 m² 的空间，缓冲液制备间需要 57 m² 的空间。使用内部制备的缓冲液浓缩液的 ILD 需要约 55 m² 的空间，使用外购浓缩液的 ILD 仅需要 20 m² 的空间。

图 10. 每种缓冲液制备方法占用的最小空间。

结论

缓冲液管理是一项耗时的活动，手动制备缓冲液可能成为主要瓶颈，尤其是当扩大生产规模时，手动制备缓冲液可能成为下游生产主要瓶颈。虽然采用 ILD 制备缓冲液同样也是一项内部活动，但是由于制备过程自动化和使用 HyClone™ 缓冲液浓缩液可以减少缓冲液制备和处理所需的人力和空间，从而节省了更多的时间和空间。

本文中的工艺经济性计算表明，与手动缓冲液制备相比，ILD 可以节省投资、工时、处理的缓冲液体积和占用空间。使用外购缓冲液浓缩液时，ILD 的优势会变得更加明显。

材料和方法

我们研究了具有 ILD 功能的 ÄKTA process™ 层析系统在不同流速下的流速精度，其中背压保持 3 bar 并使用默认的 PID 参数。根据流速精度计算不同稀释系数下的梯度精度和可接受范围，并随后在三种稀释系数和三种流速下进行测试。

资源：

大规模缓冲液管理页面

ÄKTA process™ 层析系统