优化重组蛋白纯化的疏水层析步骤

由于在纯化步骤中使用可溶性蛋白非常重要，因此需要首先研究蛋白的溶解度。缓冲液的 pH 值、盐类型和盐浓度等参数是影响蛋白溶解度的主要因素。

在本研究中检测了 96 孔板中蛋白的溶解度，蛋白所处的乙酸钠缓冲液 pH 值范围在 3.0 至 6.0 之间，并加入不同浓度的三种不同盐。评估所用的盐为氯化钠、硫酸钠和硫酸铵。缓冲液用 Tecan 工作站制备。

在 96 孔紫外板的每个孔中加入 180 µL 缓冲液，然后加入 20 µL 浓度为 16 mg/mL 的样品，使每个孔中的蛋白终浓度为 1.6 g/L。孔板在室温下孵育 30 分钟，然后用紫外检测器在 400 和 600 nm 波长处读取数值。在这两个波长下吸光度均增加，解释为蛋白出现沉淀。

结果

在图 3 和图 4 中，我们标出了所有被测缓冲液条件的紫外观测结果。橙色区域表示出现蛋白沉淀，可以观测到紫外吸光度增加，而绿色区域表示未观测到蛋白沉淀。该溶解度研究的观测结果如下：

• 由于在较低 pH 值下，氯化钠使蛋白的溶解度受到限制，因而在进一步实验中排除了该盐的使用。
• 硫酸铵在 1 M 的浓度下效果很好，而在更高的浓度下会使目的蛋白出现沉淀，如图 4 所示。于是在进一步实验中继续使用该盐（在盐浓度 <1 M 的条件下）。
• 硫酸钠在所有研究条件下同样表现良好，因此在进一步实验中也选择使用该盐。

图 3. 96 孔板实验结果，各孔含不同 pH 值、含不同浓度氯化钠和硫酸钠的 100 mM 醋酸盐缓冲液。吸光度在 400 和 600 nm 波长处测量。绿色表示无沉淀，而橙色表示有沉淀。

图 4. 96 孔板实验结果，各孔含不同 pH 值和不同浓度硫酸铵的 100 mM 醋酸盐缓冲液。吸光度在 400 和 600 nm 波长处测量。绿色表示无沉淀，而橙色表示有沉淀。

在该步骤中，我们通过改变盐的类型、盐浓度和 pH 值，并同时使用不同的填料来筛选缓冲液条件。由于研究中有四个可变的参数，因而 PreDictor™ 孔板是一个不错的选择。采用 PreDictor™ 96 孔板对具有不同疏水性的三种填料进行筛选。由于研究的目的是设计结合/洗脱精纯步骤，因而选择了高分离度的 Capto™ ImpRes 填料作为本研究的候选填料。PreDictor™ 孔板上的第三种填料是 Capto™ Phenyl (High Sub)，旨在观察其对疏水性的影响。我们使用每个孔容纳 6 µL 填料的 PreDictor™ 孔板研究静态结合载量 (SBC)，因为该板要求使用的蛋白样品量更少。孔板研究中填料的分布如图 5 所示。

该实验使用两块板进行，一块板上添加的盐为硫酸铵，另一块板上为硫酸钠。盐浓度的范围在 100 到 800 mM 之间，而 pH 值范围在 3.0 到 4.5 之间（醋酸盐缓冲液）。PreDictor™孔板在上样（体积为 200 µL）前进行平衡，使其达到各自的条件（浓度为 2.7g/L）。选择该浓度的目的是确保在孵育过程有过量的蛋白。将孔板置于定轨振荡器 (1100 rpm) 上孵育 60 分钟。通过离心分离（流穿组分）去除缓冲液，用紫外板收集缓冲液，然后在 237 和 276 nm 波长处测量所收集缓冲液的紫外吸光度。我们使用 Assist 软件评估测量结果。

如需更详细地了解操作过程信息，请参阅如何手动操作 PreDictor™ 孔板。

结果

我们观察发现，对于孔板研究中的 SBC，使用硫酸钠比使用硫酸铵高（此处未列出硫酸铵的数据）。另外，由于之前的捕获步骤中使用的就是硫酸钠，因此无需进行缓冲液置换。因此，我们选择硫酸钠进行进一步研究。在最优结合条件下（pH 值、盐和盐类型），Capto™ Butyl ImpRes 填料和 Capto™ Phenyl (High sub) 填料的 SBC 测定值都接近 40 g/L 填料（图 6）。但是，在检查非结合条件（即初步的良好洗脱条件）的孔板结果时，Capto™ Butyl ImpRes 更为理想，在低盐浓度条件下，几乎所有研究的 pH 值范围内，该填料的 SBC 都较低。另一方面，Capto™ Phenyl (High Sub) 的结合力太强，并且无法确定理想的洗脱条件。因此选择了 Capto™ Butyl ImpRes 填料进行该纯化。

图 5. SBC 研究中滤板所用填料的分布。

图 6. mAb 在不同缓冲液成分中的静态结合载量（100 mM 醋酸盐缓冲液，pH 值 3.0 至 4.5，并添加 100 至 800 mM 硫酸钠）。(A) Capto™ Phenyl ImpRes，SBC 最大为 33 mg/mL 填料，(B) Capto™ Butyl ImpRes，SBC 最大为 39 mg/mL 填料，(C) Capto™ Phenyl (High Sub)，SBC 最大为 39 mg/mL 填料。

在层析柱中进行第一次选择性研究之前，需首先确定蛋白样品的相关上样量。孔板研究的静态结合载量结果接近最大结合载量，但是如果使用动态处理层析柱进行纯化，应在相关的停留时间内测量结合载量。为此我们在 4 分钟停留时间内进行了前端分析，以测定 Capto™ Butyl ImpRes 填料对蛋白样品的动态结合载量 (DBC)。

该实验采用柱床高度 5.5 cm 的 Tricorn™ 5/50 层析柱。根据 PreDictor™ 孔板研究的结果，实验所采用的条件为 pH 值 3.0、100 mM 醋酸盐缓冲液，含 800 mM 硫酸钠。蛋白浓度为 2.0 mg/mL，并且实验采用了带有 Superloop™ 组件的 ÄKTA™ 层析系统，以便于大样本量上样。我们进行上样，直至流穿组分的吸光度达到上样蛋白溶液吸光度的 80%。使用 UNICORN™7 软件的扩展模块计算 DBC，计算结果汇总于表 2 中。

了解本文中介绍的 DBC 测定方法。

表 2. Capto™ Butyl ImpRes 填料对重组蛋白的 DBC 测定结果。

进行第一次层析以评估填料对目的蛋白和杂质的选择性。针对蛋白的上样量，选择 10% 流穿率下 (Q_B10) DBC 的 50%。根据孔板研究的结果，利用 10 个柱体积 (CV) 的 800 mM 至 0 mM 的硫酸钠进行梯度洗脱，同时 pH 值从 3.0 增至 5.5。在洗脱过程中收集组分并使用 SEC 进行片段分析。

结果

我们发现，低分子量 (LMW) 片段在洗脱峰的前半部分被洗脱，表明在洗脱前采用洗涤步骤可以提高洗脱池的纯度（图 7）。由于目的蛋白在较晚的梯度中洗脱，为了防止目的蛋白从层析柱上洗脱，在洗涤步骤中应保持高盐浓度。目的蛋白在低盐条件下洗脱，这说明在分步洗脱过程中有可能在不添加盐的情况下洗脱目的蛋白。这与后面的精纯步骤可以起到双管齐下的作用。根据我们前面所做的条件筛选研究的结果，我们发现 pH 值有可能在洗脱中起到一定的作用。为此我们在接下来的静态洗脱研究中将洗脱缓冲液的 pH 值作为一个可变参数。

图 7. 使用 10 CV、800 mM 至 0 M 浓度梯度的硫酸钠溶液进行选择性研究。层析图谱中的第一个峰对应我们制备的第一批样品中的添加剂，但后来去除了该添加剂。

将使用 pH 值为 3 的 800 mM 硫酸钠处理的蛋白样品添加到装有 20 µL Capto^TM Butyl ImpRes 填料的 PreDictor™ 96 孔板的每个孔中。上样的蛋白量相当于填料在 Q_B10 下 DBC 的 50%。使用上样缓冲液洗涤后，用洗脱缓冲液进行三次洗脱。在洗脱过程中改变洗脱缓冲液的 pH 值和盐浓度。然后分析所有洗脱液，计算总收率。

在此处可以查看孔板研究的详细过程。

结果

在 Capto™ Butyl ImpRes PreDictor™ 孔板研究中，当 pH 值在 4.5 至 5.5 之间时获得的收率最高（图 8）。我们决定使用 pH 值 5.5 进行洗脱，为了去除在洗脱峰前洗脱的 LMW 片段，我们还增加了洗涤步骤。洗涤步骤应在高盐浓度下进行，以避免洗脱目的蛋白。

图 8.Capto™ Butyl ImpRes PreDictor™ 孔板研究中三次连续洗脱过程中，在不同 pH 值-盐浓度下的收率。

洗涤步骤需要优化的参数为盐浓度和洗涤液体积。由于上样量对于分离度也很重要，因此本研究中也包括了上样量。在本研究中，我们选择了实验设计 (DoE) 方法确定最佳条件。通过采用实验设计 (DoE) 方式和 CCO 设计，我们可以优化条件，并发现所有参数之间的关系，而采用一次改变一个因子 (OFAT) 的方式是无法办到的。在实验设计 (DoE) 设置中，CCO 设计共进行了 17 次实验，如表 3 所示。这 17 次实验选择收率和纯度作为响应值，即监测结果。

结果

前 17 次实验的研究结果如图 9 和 10 的曲面图所示。经过对获得的模型进行统计数据稳健性检查后（收率和片段去除率均为 R² < 0.9 和 Q² > 0.8），该模型显示目的蛋白收率与纯度之间达到了平衡。从图中可以看出，在低盐浓度条件下，洗涤液量越高，获得的纯度越高。然而在这些条件下，收率比较低。经对实验设计 (DoE) 进行评估后，我们发现上样量最多不应超过 14g/L 填料，因此又降低上样量进行了两次实验（表 3，实验 18 和 19，未显示结果）。

然后进行蒙特卡罗模拟，由此确定了收率和纯度的限值。其中重组蛋白的收率 > 95%，LMW 杂质 < 6%。根据蒙特卡罗模拟的结果，满足 1% 失败风险要求的最佳条件是蛋白上样量为 11.3 g/L 填料，而洗涤液的盐浓度为在 4.36 CV 下 600 mM（图 11）。根据蒙特卡罗模拟的结果，盐浓度对纯度和收率的影响列于表中。4.从图 11 中绿色区域也可以看出盐浓度的影响，尽管上样量和洗涤液的盐浓度有所变化，但仍在可接受的范围内。

表 3. 实验设计 (DoE) 的层析条件

图 9. 重组蛋白纯度（低 LMW 收率 = 高蛋白纯度）与上样量、洗涤液盐浓度和洗涤液体积的关系的等值线图。

图 10. 重组蛋白收率与上样量、洗涤液盐浓度和洗涤液体积的关系的等值线图。

图 11. 实验设计 (DoE) 所确定模型的蒙特卡罗模拟。绿色区域表示使用 4.36 CV 洗涤液体积时失败概率小于 1% 的区域。可接受的结果为目的蛋白收率 > 95% 和 LMW 片段 < 6%。

表 4. 洗涤液盐浓度对收率和纯度的预期影响

验证运行的条件采用蒙特卡罗模拟提供的最佳条件（图 12）。在一个 20 cm 的 Tricorn™ 5/200 层析柱中进行（之前实验的柱床高度为 10 cm）验证运行，结果应接近蒙托卡罗模拟的结果。

层析柱：Tricorn™ 5/200
样本：重组蛋白 (2.0 mg/mL)
上样量: 11.3 mg/mL
平衡缓冲液和样品缓冲液：100 mM 醋酸盐，800 mM 硫酸钠，pH 值 3.0
洗涤液: 100 mM 醋酸盐，600 mM 硫酸钠，pH 值 5.5，0.25 mL/min，4.36 CV
洗脱缓冲液：100 mM 醋酸盐，pH 值 5.5，5 CV
CIP：1 M NaOH，0.25 mL/min，2 CV
再平衡：平衡缓冲液，0.5 mL/min，5 CV
系统：ÄKTA pure™ 25
检测波长：237 nm

图 12. 使用 Capto™ Butyl ImpRes 填料进行重组蛋白的验证运行。

结果

验证运行的单体收率为 98%，洗脱液中的片段含量为 6.0%。与含有 14.9% 片段的起始样品相比，杂质最高减少了 2.5 倍。验证结果也列在表 5 中，可以看出结果与蒙特卡洛模拟的预期结果非常吻合。

表 5. 与验证实验结果相比的预期结果

本文介绍了使用 HIC 填料优化重组蛋白中间纯化步骤条件的工作流程。目标是实现目的蛋白的高收率并显著提高纯度，在我们本次的研究中即为减少 LMW 片段的含量。

本次研究利用孔板研究分析了三种填料的结合载量，它们分别是 Capto™ Butyl ImpRes、Capto™ Phenyl ImpRes 和 Capto™ Phenyl (High Sub)。由于 Capto™ Butyl ImpRes 结合载量高，并在确定的洗脱条件下具有获得良好收率的潜力，因而选择它进行层析柱研究。

采用实验设计 (DoE) 优化洗涤步骤及其他层析参数，以提高重组蛋白的纯度，并使用 Tricorn™ 5/100 层析柱进行验证运行，以确认实验设计 (DoE) 的结果。然后进行蒙特卡罗模拟以确定达到预期收率和纯度的稳健条件。在确定的条件下进行了验证运行并达到了预期结果，即片段含量由 15% 降为 6%，单体收率为 98%。

通过分析结果我们发现，增加精纯步骤对于进一步减少杂质（包括此次未研究的其他杂质在内）是非常有利的。精纯步骤的选择应具有正交特点，具体到本研究可以使用阴离子交换层析法。

此外，还有一种工具可以节省时间和创建更稳健的工艺，那就是机理建模。机理建模利用计算机模拟来减少实验次数。

CY27574-27Oct22-AN

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