常见问题

首先根据不同的种属亚型参考“相对结合强度”表(如下图),Protein A和Protein G 均结合抗体的重链部分,若存在 Protein A 及 Protein G 都有较强结合能力时, 更加推荐 Protein A。 Protein A 的洗脱条件(pH 3.5–4.5)较 Protein G(< pH 3)更加温和,利于对低 pH 敏感抗体的稳定性。 另外, Protein A 有耐碱清洗的 PrismA或 SuRe 配基可供选择,且载量更高。 尤其是纯化多个抗体,为了避免交叉污染,优先推荐耐碱清洗的填料,长久使用更经济。

Protein G Sepharose 来源于链球菌, 为细胞表面的 III 型 Fc 受体。 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG、 多克隆 IgG 及人 IgG。同时, 重组表达的 Protein G 去除了 N 端白蛋白结合结构域, 血清蛋白结合水平更低。 此外,Protein G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F (ab’)2 段结合。 但是,其工业化程度低于 Protein A。

Protein L结合抗体的轻链可变区,适合抗体片段的纯化。同时Protein L对于某些种属亚型有结合能力,可以作为Protein A和Protein G的有效的补充。

可以将 Protein A 和 Protein G 填料进行 1:1 混合,然后纯化。Cytiva 提供 Protein A 和 Protein G 预混合的重力柱 rProtein A/Protein G GraviTrap,货号 28985256。 也可以查询文献作为参考。

不同配基结合特征如下:

  • rProtein A 和 PrismA 配基可以结合抗体 Fc 区域以及重链可变区VH3。
  • Protein G 配基除了与 IgG 的 Fc 区域特异性结合,还可以和某些抗体的 Fab 段结合。
  • Protein L 配基对于人 kappa I, III 和 IV 亚型以及小鼠的 K1 轻链有很强的亲合力,结合位点在 Kappa 轻链的可变区。
  • KappaSelect 层析介质与人 KappaFab ( 恒定区 ) 结合,以及LambdaFabSelect 层析介质与人 LambdaFab( 恒定区 ) 结合。

PrismA 填料,配基是改造的耐碱配基 PrismA,保留了与VH3 的结合能力,可以用于 VHH 的亲和捕获。耐 1M NaOH 和高载量,为首选。 rProtein A 的配基填料,包括MabSelect抗体纯化层析填料、 MabSelect Xtra 和rProtein A。注意 : SuRe 配基,如 MabSelect SuRe 和 MabSelect SuRe LX 不行。 SuRe 配基是一个同型四聚体配基,避免了不同配基结构域与抗体Fc 段亲和性的差异,也消除了对某些 Fab 段的亲和作用,不能用于 Fab 区样品结合。

多种方法,如下:

  • 磁珠产品:Protein A(或 Protein G) Mag Sepharose Xtra,高配基密度,适合抗体小规模纯化,不建议用于 Co-IP。
  • 重力柱:rProtein A 或 proteinG GraviTrap。更小体积样品,可以选择 SpinTrap 或 96 孔板形式的 MultiTrap 进行克隆筛选。
  • 自行装填重力柱:购买 PD-10 空柱 ( 货号 17043501,总体积约 13 mL,膜孔径 20-85 um), LabMate PD-10 Buffer Reservoir 缓冲液储槽,可额外增加 PD-10 缓冲液体积25 mL。
  • HiTrap 柱子,使用 1/16" Male/Luer Female 转接头 ( 货号18111251),用鲁尔注射器操作。

腹水中经常含有高浓度的脂蛋白,这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱,最好能在纯化之前去除。方法一是在二价离子存在的情况下,硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白,沉淀可以通过离心除去;方法二是PVP 能产生一个 pH 值依赖的沉淀效应, PVP 在 pH= 7.0 时能够沉淀 β- 脂蛋白和球蛋白。另外,有些客户也会使用硫酸铵沉淀法。具体操作方法请参考抗体纯化手册。

  1. Protein G 或 Protein A Mag Sepharose 磁珠,通过磁力架操作,最短处理时间约 30 分钟。
  2. Protein G ( 或 Protein A) HP SpinTrap,通过离心方式操作,在短时间(45 分钟 )内轻松处理。
  3. 购买散装填料。将 Protein A 与 Protein G 等比 (体积比 1:1)混合或单独使用。也可以选择 Immunoprecipitation Starter Pack,货号 17600235,含 2ml Protein G Sepharose 4 Fast Flow 抗体纯化填料 和 nproteinA Sepharose 4 FF 填料。

普通的 Protein G 和 Protein A 配基,不耐碱,清洗效果差,使用次数很有限。建议反向清洗:

  1. 对于沉淀或变性的蛋白:用 6M 盐酸胍清洗 2 个柱体积,立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗,反向冲洗,每次清洗时间不超过 10min。
  2. 对于去除疏水性的物质 ( 如疏水性蛋白、脂蛋白、脂质 ):使用非离子型去污剂,如 0.1% Triton X-100, 37 度孵育 1 min。立即用至少 5 个柱体积的无菌结合缓冲液清洗;或者 70% 乙醇浸泡12 小时左右,然后立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗。注意 70% 乙醇处理时,粘稠故压力大,需要降低流速。

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