GST 标签

Glutathione Sepharose 4B典型特点就是载量高，但是骨架软不耐压，不建议用于规模放大。

三种填料的主要性质差异可参考下图：

1. 离心柱 SpinTrap ：可应用于小规模的对细菌裂解液进行筛选或者小规模的细胞裂解液的纯化。
2. 重力柱 GraviTrap ：重力操作，样品与填料的孵育可在柱外进行，孵育时间可根据结合强弱进行灵活调整。也可以用 PD-10空柱，自行装填相应的亲和层析填料。购买 PD-10 空柱（货号17043501，总体积约 13 mL）， LabMate PD-10 Buffer Reservoir 缓冲液储槽，可额外增加 PD-10 缓冲液体积25 mL。
3. 多孔板 MultiTrap ：离心或真空操作，可提供高通量的平行筛选。
4. HiTrap 1 mL/5 mL 柱子，使用 1/16"" Male/Luer Female 转接头用鲁尔注射器操作。
5. 部分填料也可以采用直接在 EP 管中离心的方式操作，例如Glutathione Sepharose 4B 说明书中Batch purification。离心力控制在500-700 g 以内。

可能的原因以及解决方法如下：

1. 样品制备超声过度 / 不够 ：加入溶菌酶促进裂解。
2. GST 氧化聚集 ：加入 DTT( 常用 1 – 10 mM) 能增加蛋白的结合。
3. 结合条件 ：确保结合缓冲液的 pH 在 6.5 – 8 之间，否则结合效率低 ； GST 结合动力学慢，可降低上样流速。
4. 载量不够 ：使用更大体积的柱子 ；使用 Glutathione Sepharose 4B 的柱子。
5. 确保柱子按说明书正确再生处理。
6. GST 构象改变，结合较弱 ：验证 GST 空载蛋白的表达及结合填料的能力，看是否由于重组蛋白影响了 GST 构象。可以降低结合温度至 4℃并减少 wash 清洗次数。

可能的原因以及解决方法如下：

1. 蛋白降解：避免过度超声；添加蛋白酶抑制剂PMSF 或其替代品AEBSF；确保使用蛋白酶缺失的宿主，如E. coli BL21；使用GSTrap FF 增加上样流速缩短上样时间。
2. 70 kDa 伴侣蛋白共洗脱：纯化前使用含有2 mM ATP，10 mM MgSO₄，50 mM Tris-HCl (pH 7.4)的缓冲液在37℃ 孵育 10 分钟，以解离复合物 ；或者增加后续的纯化步骤。

根据不同载体选择不同的酶进行酶切：

1. PreScission Protease (27084301) 可在 4℃下酶切，并自身含有一个 GST 标签，可通过 GST 柱去除。
2. Thrombin (27084601)或 Factor Xa (27084901) 需要室温下酶切，酶切后可用苯甲脒的柱子 HiTrap Benzamidine FF 一步去除多余的酶。

• 去除沉淀或变性的物质 ： 2 倍柱体积 6 M 盐酸胍，然后用5 倍柱体积 pH 7.3 的 PBS 平衡。
• 去除疏水结合的物质 ： 3 – 4 倍柱体积 70% 乙醇 ( 或者 2 倍柱体积 1% Triton X-100) 洗涤，之后立即用 5 倍柱体积 pH 7.3 的PBS 平衡。