作者：Iijima M et al.
发表日期：2019年4月
发表期刊：Acta Biomaterialia
研究背景
在过去的三十年中，抗体药物已成为治疗各种疾病的重要药物，譬如癌症、风湿病、高胆固醇血症等等。尽管在体内显示出良好的治疗效果和良好的安全性，但抗体药物在使用时通常需要高剂量。
本研究使用酵母合成的乙型肝炎病毒 (HBV) 包膜L颗粒是一种约30 nm的中空纳米颗粒，已被开发为生物纳米胶囊 (bionancapsule, BNC)，是一种携带乙肝病毒衍生的人类肝脏特异性早期感染机制的药物传递系统 (DDS) 纳米载体。由于BNC的主干与传统乙肝疫苗的免疫原相同，因此BNC被认为是一种安全的生物材料。在最近的研究中，BNC的外结构域被金黄色葡萄球菌蛋白A的IgG Fc结合Z结构域串联形式取代，生成一个称为ZZ-BNC的复合体。ZZ-BNC显示所有的IgG Fv区域向外可以有效结合抗原。ZZ-BNC也是一种极好的IgGs支架，可以定向固定提高免疫传感器，提高灵敏度、抗原结合能力和亲和力。因此，我们试图增强抗体药物偶联的ZZ-BNC的亲和力，从而显著减少抗体药物的剂量。
实验方法
将质粒pGLD-ZZ50转染到AH22R-酵母细胞中，过表达ZZ-BNC，细胞处于生长停滞期后，就进行收获，4℃下离心15 min。使用缓冲液 A (pH 7.4、7.5M尿素、0.1 M Tris-HCl、50 mM NaH2PO4、15 mM EDTA、0.1% Tween 80) 和4 mM PMSF进行重悬。得到的细胞裂解，在包含1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液 (PBS、137 mM NaCl、2 mM KCl、8 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4) 中4℃裂解2h。在包含1 mM EDTA的PBS中4℃透析过夜。
上述样品70℃下水浴20 min，然后马上冰水浴，在4℃下34780 g离心30 min，去除不溶组分，上清过0.45 μm PVDF膜，备用。
拿到的样品使用磷酸化纤维素柱进行粗纯，使用pH 7.2，含有0.15 M NaCl的10 mM PBS缓冲液对层析柱进行平衡，组分使用不同NaCl进行洗脱，洗脱的组分通过超滤管进行浓缩。
浓缩后的样品再次使用0.45 μm PVDF膜进行过滤后，样品加载到Sephacryl S-500 HR (1.6 × 60 cm)凝胶过滤层析柱上，使用B缓冲液 (PBS、1mM EDTA、0.005% Tween80) 以0.5 ml/min流速进行洗脱，洗脱下来的组分进行过过滤，冻干，备用。
纯化得到的ZZ-BNC进行加CF488A标签，以及偶联α-hEGFR IgG和小鼠总IgG分别生成CF488-ZZ-BNCs、α-hEGFR-ZZ-BNCs和mIgG-ZZ-BNCs分子。
抗体药物自发结合到ZZ-BNC上，并呈现向外显示IgG Fv区域。人表皮样癌A431细胞内吞偶联的抗人表皮生长因子受体IgG (α-hEGFR-ZZ-BNC)，与单用α-hEGFR IgG相比，细胞摄取增加约1.5倍。与ZZ-BNC结合后，晚期核内体和溶酶体中α-hEGFR IgG的含量由4%提高到33%。α-hEGFR- ZZ - BNC的体外细胞毒性比单独的α-hEGFR IgG高约10倍。与单独使用α-hEGFR IgG相比，α-hEGFR- ZZ - BNC能明显抑制体内肿瘤生长。ZZ - BNC是一种很有前途的纳米支架，可以提高治疗效果，减少抗体药物的剂量。用上述方法，同样制备SPANb-FITC偶联物，以及将MPS替换成DSPE-PEG-NBD以制备MPS-NSSLs-NBD/NSSLs-NBD。
后续使用偶联的纳米颗粒处理裸鼠，结果表明，利用SP-A作为肺靶向制剂，克服了SP-A整体抗体分子量大、吞噬肝/脾能力强、免疫原性强等缺陷。用PEG对颗粒进行亲水性修饰，降低了细胞吞噬作用，增加了颗粒的尺寸稳定性。封装效率高达90%，4℃下稳定保存不少于12周。使用FITC-SPANb和MPS-NSSLs-SPANb对比注射后，证实MPS-NSSLs-SPANb具有很高的特异性。药代动力学结果同时表明MPS-NSSLs-SPANb组的MPS浓度在各时间点均高于MPS组。动物实验表明，MPS-NSSLs-SPANb用于肺损伤治疗有效，毒性较小。MPS-NSSLs-SPANb显著降低大鼠BALF中TNF-a、IL-8、TGF-b1表达，以及肺组织中NF-jB表达。MPS-NSSLs-SPANb治疗过程中未见增加感染的机会。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28935606 | HiPrep 16/60 Sephacryl S-500 HR | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17061310 | Sephacryl S-500 HR | 150 mL |
| 空柱 | 28988946 | Column XK 16/70 | 16/70 |
