作者:Shatz W et al.
发表日期:2019年6月
发表期刊:PLoS One


研究背景

聚乙二醇 (PEG) 在生物技术和药物开发领域有着悠久的历史,并且常用在脂质体的纯化中。因为PEG作为药物的递送载体具有许多优势,例如,可以增加溶解度,延长半衰期,并且可以降低免疫原性。到目前为止,许多具有不同链长和分散性的PEG被用于药物的脂质体递送体系中。

衰老相关的眼病是造成失明和视力不佳的最常见的原因之一。往往在治疗时需要通过玻璃体内注射 (IVT) 来输送药物。而这种给药方式通常的药物半衰期小于10天,所以需要频繁给药。所以目前亟需开发一种可以延长药物在眼睛中停留时间的治疗方法。

在本文中,作者报告了一种通过使用抗补体因子D的抗体 Fab片段修饰的PEG脂质体延长药物半衰期的策略。具体来说,作者筛选了结构、长度、几何形状和分支程度不等的PEG分子来包装Fab抗体片段。最终,体外筛选得到的PEG分子包装了治疗性抗体片段后,在猴动物模型上进行药物耐受性和药代动力学的研究,证明表面抗体药物经过PEG包装后在玻璃体内半衰期被有效延长,且无相关不良反应产生。

实验方法

  1. 抗体片段表达与纯化
    通过原核表达系统 E.coli重组表达。细菌破碎上清首先使用亲和层析进行抗体的捕获,使用的是Protein G- Sepharose填料;之后,使用离子交换层析进行抗体片段的精纯,使用的是SP HP填料。
  2. 抗体片段与PEG的共价偶联
    使用Maleimide活化纯化得到的Fab C端的Cysteine,然后与PEG共价偶联。具体来说,将PEG分子置换到pH5的醋酸钠缓冲液中,将Fab片段置换到pH6.5的HEPES缓冲液中,然后将PEG、Fab、Maleimide室温搅拌过夜。对于混合组分,使用S-100的分子筛进行纯化,分离与PEG偶联的Fab片段、未偶联的Fab片段。为了进一步保证脂质体的纯度,使用SP HP填料进行离子交换层析。
  3. 修饰后脂质体的表征
    为了将纯化得到的治疗用脂质体用于进一步的体外及动物实验中,作者使用多种检测手段对脂质体进行表征,包括,SEC-MALS、RP-LCMS、SDS-PAGE等等。脂质体粗提液的制备
    首先制备脂质双分子薄膜,然后准备含5 mM钙黄绿素的250 mM Tris-HCl pH 8.0水化缓冲液,将上述水化液转移到制备好的薄膜上,制作囊泡,随后用100 nm的聚碳酸脂膜进行脂质体挤出,制备脂质体粗液。

产品信息

类别 货号 产品名称 规格
预装柱 17547055 HiTrap Capto Q ImpRes 5 × 5 mL
预装柱 17116501 HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR 1 × 120 mL
填料 17061801 Protein G-Sepharose 4 FF 5 mL

Reference
Shatz W, Hass PE, et al,. Identification and characterization of an octameric PEG-protein conjugate system for intravitreal long-acting delivery to the back of the eye. PLoS One. 2019 Jun 28;14(6):e0218613.