作者:Alexander Katsyv et al.
发表日期:2021年03月
发表期刊:FEBS Open Bio
研究背景
Wood–Ljungdahl pathway (WLP) 是最早出现在地球的CO2固定代谢途径,它依赖严格的厌氧微生物产乳酸菌、产甲烷菌、硫化菌和古生菌。在WLP途径中2分子CO2 转化为中央代谢的乙酰辅酶A (acetyl-CoA)。产乙酸菌再转化为乙酸。大多数产乙酸菌可以维持无机自养的生命循环,使用H2和CO作为电子供体固定CO2生成乙酸。
WLP途径的ATP得失为零,因此根据化学渗透假说,它们需要能量的转化来维持细胞代谢的平衡。自养代谢和异养代谢的中心环节就是乙酰辅酶A。2个关键酶作用于这一环节,分别是一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶 (CODH/ACS),结合了WLP途径中的甲基和CO,而丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 可以还原乙酰辅酶A羧酸盐到丙酮酸。
PFOR是细菌厌氧代谢的关键酶,从低电势的铁氧还蛋白 (Fd2) 作为电子载体,此酶可以用作酶促反应的辅酶,在需要Fd作为电子受体的反应中,比如电子差异酶,以维持还原性Fd的恒定水平。
实验方法
在66℃的厌氧条件下培养T. kivui菌,优化微量元素,通H2和N2。收集细胞破碎130,000 g离心,4℃ 60 min收集上清。
在T. kivui中重组表达non-tagged PFOR和His-tagged PFOR1纯化路线。
PFOR透析到50 mM Tris-HCl,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 8.0进行阴离子交换层析捕获。3-13 mM NaCl 或电导3.8–8.4 mS/cm洗脱。样品加入1 M AMS进行疏水相互作用层析中度纯化,50 mM Tris-HCl,20 mM MgSO4,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,,pH 7.5线性洗脱。50 kDa VIVASPIN 超滤浓缩,衔接凝胶过滤尽行精细纯化,50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,20 mM MgSO4,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 7.5,获得单峰。
PFOR1捕获步骤为镍柱亲和层析,30 mM imidazole洗杂,50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,20 mM MgSO4,400 mM imidazole,0.5 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 7.5洗脱,超滤后衔接凝胶过滤精纯。
非标签PFOR纯化倍数为50.4,三步纯化的回收率3.6%。his标签PFOR1的纯化倍数为35.8,两步纯化的回收率为93.9%。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
---|---|---|---|
预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 x 24 mL |
填料 | 17101401 | Q Sepharose HP | 75 mL |
填料 | 17108201 | Phenyl Sepharose High Performance | 75 mL |
填料 | 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 mL |
超滤管 | 28932362 | Vivaspin 20, MWCO 50 kDa | 12个 |
空柱 | 28988946 | Column XK 16/70 | 16/70 |