作者:Alice R. Mazzer et al.
发表日期:2015年9月
发表期刊:Journal of Chromatography A
研究背景
蛋白 A 层析是一种在生物过程中几乎无处不在的 mAb 捕获方法。已知使用低 pH 缓冲液从蛋白质 A 中洗脱会导致产物聚集。然而,一组更有力的证据表明,低 pH 值可能不是蛋白质 A 色谱中聚集的唯一原因,相反,该过程的其他方面可能对样本聚集有显著影响。本文提出了一种明确的方法来研究这个问题。
在蛋白 A 层析(典型的病毒灭活保持)后,将 IgG4 在洗脱缓冲液中孵育,并通过大小排阻层析确定中和样品中的单体数量;使用预先确定的不同pH值的洗脱缓冲液以诱导IgG4的聚集。通过将指数衰减函数拟合到数据来确定单体随时间衰减的速率常数。在没有色谱步骤的情况下进行了类似的实验,即低 pH 下的 IgG4 聚集。蛋白 A 层析后聚集的速率常数明显高于单独暴露于低 pH 值的速率常数; 在测试的 pH 范围内,聚集率的明显变化是明显的。
实验方法
用于所有实验的IgG 分子由 UCB Celltech (UCB Celltech, Slough, UK) 捐赠。 它是一种纯化的IgG4 kappa 抗体; 铰链区没有突变。IgG 在 270 mM 甘氨酸、1% 麦芽糖、pH 5.0 中配制为 17.8 mg/mL。 该IgG4 κ 的PI在6.85和8.15之间。
首先,1 mL HiTrap MabSelect Xtra 柱用 3个柱体积 0.02 M 磷酸钠,pH 6.7 平衡,并使用样品环将 2 mL 5.6 mg/mL IgG4上样到柱上。用 3CV 0.02 M 磷酸钠,pH 6.7洗杂,并使用 5CV 0.15 M 甘氨酸-HCl,pH 2.93 对蛋白质进行分步洗脱。 通过在 280 nm 处的吸光度监测产物,并在整个洗脱过程中收集 0.5 mL 馏分。
接下来用0.1 M 磷酸钠、276 mM NaCl、pH 6.3作 SEC 的流动相缓冲液。 流速为 1 mL/min,进样体积为 20 uL。 通过280nm处的吸光度检测峰。 在注射到 SEC 柱上之前,所有样品都以 13,000 rpm 的速度离心去除沉淀。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
---|---|---|---|
预装柱 | 28408258 | HiTrap MabSelect Xtra | 5 × 1 mL |
填料 | 17526907 | MabSelect Xtra | 25 mL |