作者：Alice R. Mazzer et al.
发表日期：2015年9月
发表期刊：Journal of Chromatography A

研究背景

蛋白 A 层析是一种在生物过程中几乎无处不在的 mAb 捕获方法。已知使用低 pH 缓冲液从蛋白质 A 中洗脱会导致产物聚集。然而，一组更有力的证据表明，低 pH 值可能不是蛋白质 A 色谱中聚集的唯一原因，相反，该过程的其他方面可能对样本聚集有显著影响。本文提出了一种明确的方法来研究这个问题。

在蛋白 A 层析（典型的病毒灭活保持）后，将 IgG4 在洗脱缓冲液中孵育，并通过大小排阻层析确定中和样品中的单体数量；使用预先确定的不同pH值的洗脱缓冲液以诱导IgG4的聚集。通过将指数衰减函数拟合到数据来确定单体随时间衰减的速率常数。在没有色谱步骤的情况下进行了类似的实验，即低 pH 下的 IgG4 聚集。蛋白 A 层析后聚集的速率常数明显高于单独暴露于低 pH 值的速率常数； 在测试的 pH 范围内，聚集率的明显变化是明显的。

实验方法

用于所有实验的IgG 分子由 UCB Celltech (UCB Celltech, Slough, UK) 捐赠。 它是一种纯化的IgG4 kappa 抗体； 铰链区没有突变。IgG 在 270 mM 甘氨酸、1% 麦芽糖、pH 5.0 中配制为 17.8 mg/mL。 该IgG4 κ 的PI在6.85和8.15之间。

首先，1 mL HiTrap MabSelect Xtra 柱用 3个柱体积 0.02 M 磷酸钠，pH 6.7 平衡，并使用样品环将 2 mL 5.6 mg/mL IgG4上样到柱上。用 3CV 0.02 M 磷酸钠，pH 6.7洗杂，并使用 5CV 0.15 M 甘氨酸-HCl，pH 2.93 对蛋白质进行分步洗脱。 通过在 280 nm 处的吸光度监测产物，并在整个洗脱过程中收集 0.5 mL 馏分。

接下来用0.1 M 磷酸钠、276 mM NaCl、pH 6.3作 SEC 的流动相缓冲液。 流速为 1 mL/min，进样体积为 20 uL。 通过280nm处的吸光度检测峰。 在注射到 SEC 柱上之前，所有样品都以 13,000 rpm 的速度离心去除沉淀。

产品信息

Reference
Alice R. Mazzer et al.Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A, 1415 (2015) 83–90