作者:Tao Wang et al.
发表日期:2024年3月1日
发表期刊:Mabs
研究背景
为了提高抗体的选择性和疗效,本研究开发了一种名为 Gentulizumab(GenSci059)的人源化抗 CD47 单克隆抗体,其通过293E 细胞表达,且表达上清液经 0.22 μm 滤膜过滤,该抗体最终通过 MabSelect SuRe (Cytiva)亲和层析柱进行纯化。该抗体可选择性地与 CD47 结合,有效阻断 CD47/SIRPα 轴信号通路,增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,表现出强大的抗肿瘤活性和良好的安全性,有望成为一种有效的癌症治疗药物。
实验方法
抗原表达:构建由人 CD47 细胞外区域和 hIgG1Fc 组成的基因片段并克隆到 pcDNA3.1 载体中,重组载体瞬时转染到 293F 细胞中进行表达,使用ÄKTA蛋白层析系统对表达的抗原进行纯化。
免疫动物:用纯化的抗原对 Balb/c 小鼠进行免疫。收集免疫小鼠的脾脏细胞,然后与 P3X63Ag8.653 骨髓瘤细胞一起进行杂交。融合两周后,收集细胞上清进行 ELISA 和功能检测。
抗体筛选:筛选出阳性杂交瘤细胞系并培养 7 天,收集上清液,然后通过protein A 亲和层析进行纯化。通过综合筛选,从单克隆细胞系中选出了潜力最大的单克隆抗体(克隆编号为 1.43.1)。
抗体人源化:为使小鼠衍生的抗人 CD47 mAb(1.43.1)人源化,将互补决定区(CDR)残基嫁接到人的种系框架上,去除可能的翻译后修饰(PTM)基序,确定了五组合适的框架区(FR)序列,对 25 种抗体的表达量和结合特性进行了评估。
抗体制备:在 Freestyle 培养基中使用 293E 细胞瞬时表达最终候选抗体。上清液经 0.22 μm 滤膜过滤,然后通过 MabSelect SuRe (Cytiva)亲和层析柱。筛选出的人源化抗体被命名为 Gensci059。纯化后的抗体保存在 4 ℃以备后续使用。
抗体评估:使用流式细胞仪和表面等离子体共振(SPR)方法评估GenSci059 与 CD47 的结合能力,通过竞争性 ELISA 试验评估Gen- Sci059 对 CD47-SIRPα 相互作用的抑制作用。利用体外巨噬细胞模型和体内患者异种移植(PDX)模型评估 GenSci059 的抗肿瘤活性。使用血细胞进行结合试验以评估 GenSci059 的安全性。最后,在非人灵长类动物身上进行了毒性研究,以评估 GenSci059 的潜在风险。
推荐产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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预装柱 | 11003495 | HiTrap MabSelect Sure | 5 × 5 mL |
填料 | 17543801 | MabSelect SuRe | 25 mL |