作者：Liang Z et al.
发表日期：2017年1月
发表期刊：Vaccine

研究背景

边缘无形体是一种由蜱虫为媒介传播的破坏性病原体，可引起牛无形体病，进而导致牛发生贫血、流产甚至死亡，给养牛业造成巨大的经济损失。现有的预防策略是为牛注射边缘链球菌株的活疫苗，但由于此活疫苗还是会导致轻度的无形体，且还有传播其它病原体和恢复毒性的风险，因此不能在美国等国家获得许可。目前迫切需要更安全、更有效和更具成本效益的新一代边缘葡萄球菌亚单位疫苗。

边缘单胞菌膜蛋白VirB9-1是一种有前途的疫苗接种抗原，且可溶的重组VirB9-1蛋白可以从大肠杆菌中表达和纯化，实验也证实可诱导小鼠高水平的体检免疫和细胞免疫。本文中，作者以部分纯化的VirB9-1蛋白为抗原，其中聚集体和内毒素可进一步增强特异性抗体反应，配以纳米空心二氧化硅囊泡为佐剂，制备纳米疫苗。

实验方法

本文通过两步法纯化重组VirB9-1蛋白。首先构建载体pGEX-4T1，转导至E.coli DE3 pLysS菌株中生产表达带GST标签的重组VirB9-1蛋白。菌株离心后，弃去上清，使用裂解缓冲液（40 mM Tris-base，200 mM NaCl，1 mM EDTA，5%甘油，5 mM DTT，pH 8.0）进行重悬，重悬后在冰上进行超声破碎。裂解液在27000 h下，4℃离心20 min，获得上清后，使用0.45 μm滤膜进行过滤备用。

过滤后的上清液加载到GSTrap HP 5 mL亲和层析柱上，层析柱提前用裂解缓冲液平衡5 CV，加载样品后，洗杂4 CV后使用洗脱缓冲液（40 mM Tris-base，50 mM NaCl，1 mM EDTA，5% 甘油，5 mM DTT，10 mM GSH，pH 8.5）进行洗脱。洗脱的组分加载到Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤层析柱进行精纯，层析柱使用洗脱缓冲液平衡1 CV，上样后，继续用洗脱缓冲液洗脱蛋白，去除聚集体以及小分子污染物。第一步亲和层析得到的组分作为部分纯化的VirB9-1蛋白，第二步凝胶过滤层析后得到的组分作为纯化的VirB9-1蛋白。

纯化的VirB9-1蛋白使用Vivaspin 2超滤管，使用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.5，300 mM NaCl）4℃下处理过夜，使用阴离子交换柱以去除内毒素。为了降低疫苗的成本，蛋白质抗原的纯度与产量需要做权衡，为了更高的纯度，牺牲了产量。然后，对于动物疫苗蛋白抗原，只要疫苗具有足够的功效，且不良反应相对较低，纯度相对较低是可以接受的，故后续作者通过部分纯化抗原以降低动物疫苗的总成本。

部分纯化的VirB9-1使用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.5，300 mM NaCl）4℃下过夜进行换液，然后使用Q Sepharose填料4℃下混合孵育15 min后，在500 g下离心5 min，收集上清，此步骤重复4次，用以降低内毒素水平。

后续小鼠实验表明，组装的SV-100纳米颗粒疫苗表现比阳性对照奎尔A更好的效果，只需少量的抗原即可诱导高水平的IgG帝都以及IFN-c分泌，且无毒性，具有良好的生物相容性，且纳米颗粒的大小孔径均易于控制，为未来兽用疫苗配方的改进提供了新的理论依据。

产品信息

Reference
Zhao L , Cavallaro A S , D Wibowo, et al. A partially purified outer membrane protein VirB9-1 for low-cost nanovaccines against Anaplasma marginale[J]. Vaccine, 2017, 35(1):77-83.