作者:Liang Z et al.
发表日期:2017年1月
发表期刊:Vaccine
研究背景
边缘无形体是一种由蜱虫为媒介传播的破坏性病原体,可引起牛无形体病,进而导致牛发生贫血、流产甚至死亡,给养牛业造成巨大的经济损失。现有的预防策略是为牛注射边缘链球菌株的活疫苗,但由于此活疫苗还是会导致轻度的无形体,且还有传播其它病原体和恢复毒性的风险,因此不能在美国等国家获得许可。目前迫切需要更安全、更有效和更具成本效益的新一代边缘葡萄球菌亚单位疫苗。
边缘单胞菌膜蛋白VirB9-1是一种有前途的疫苗接种抗原,且可溶的重组VirB9-1蛋白可以从大肠杆菌中表达和纯化,实验也证实可诱导小鼠高水平的体检免疫和细胞免疫。本文中,作者以部分纯化的VirB9-1蛋白为抗原,其中聚集体和内毒素可进一步增强特异性抗体反应,配以纳米空心二氧化硅囊泡为佐剂,制备纳米疫苗。
实验方法
本文通过两步法纯化重组VirB9-1蛋白。首先构建载体pGEX-4T1,转导至E.coli DE3 pLysS菌株中生产表达带GST标签的重组VirB9-1蛋白。菌株离心后,弃去上清,使用裂解缓冲液(40 mM Tris-base,200 mM NaCl,1 mM EDTA,5%甘油,5 mM DTT,pH 8.0)进行重悬,重悬后在冰上进行超声破碎。裂解液在27000 h下,4℃离心20 min,获得上清后,使用0.45 μm滤膜进行过滤备用。
过滤后的上清液加载到GSTrap HP 5 mL亲和层析柱上,层析柱提前用裂解缓冲液平衡5 CV,加载样品后,洗杂4 CV后使用洗脱缓冲液(40 mM Tris-base,50 mM NaCl,1 mM EDTA,5% 甘油,5 mM DTT,10 mM GSH,pH 8.5)进行洗脱。洗脱的组分加载到Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤层析柱进行精纯,层析柱使用洗脱缓冲液平衡1 CV,上样后,继续用洗脱缓冲液洗脱蛋白,去除聚集体以及小分子污染物。第一步亲和层析得到的组分作为部分纯化的VirB9-1蛋白,第二步凝胶过滤层析后得到的组分作为纯化的VirB9-1蛋白。
纯化的VirB9-1蛋白使用Vivaspin 2超滤管,使用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 6.5,300 mM NaCl)4℃下处理过夜,使用阴离子交换柱以去除内毒素。为了降低疫苗的成本,蛋白质抗原的纯度与产量需要做权衡,为了更高的纯度,牺牲了产量。然后,对于动物疫苗蛋白抗原,只要疫苗具有足够的功效,且不良反应相对较低,纯度相对较低是可以接受的,故后续作者通过部分纯化抗原以降低动物疫苗的总成本。
部分纯化的VirB9-1使用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 6.5,300 mM NaCl)4℃下过夜进行换液,然后使用Q Sepharose填料4℃下混合孵育15 min后,在500 g下离心5 min,收集上清,此步骤重复4次,用以降低内毒素水平。
后续小鼠实验表明,组装的SV-100纳米颗粒疫苗表现比阳性对照奎尔A更好的效果,只需少量的抗原即可诱导高水平的IgG帝都以及IFN-c分泌,且无毒性,具有良好的生物相容性,且纳米颗粒的大小孔径均易于控制,为未来兽用疫苗配方的改进提供了新的理论依据。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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预装柱 | 17528201 | GSTrap HP | 1×5 mL |
预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 10/300 |
填料 | 17051010 | Q Sepharose FF | 25 mL |
超滤管 | 28932247 | Vivaspin 2 MWCO 10000 | 400 μL-2 mL |