作者:Geddie M L et al.
发表日期:2017年1月
发表期刊:Mabs
研究背景
以抗体为靶点的纳米颗粒可以通过增加药物内化后的生物利用度和增加在肿瘤内的微分布,用以改善脂质体药物的传递,因此被广泛考虑作为抗癌药物,但由于抗体的热稳定性差以及与亲和结合障碍问题限制了很多以抗体为靶点的纳米颗粒进入临床。
本研究作者开发一种以EphA2靶向抗体片段用于免疫脂质体药物传递的单链可变片段scFv。EphA2是一种酪氨酸激酶受体,通常在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤细胞上过表达。最初鉴定的抗体在过表达EphA2细胞系中具有很强的内化特性和生物活性,然后对单链Fv进一步表征表明,具有较低的解构温度,且不能很好地与亲和天了解和,于是作者对scFv结构进行修饰,提高其热稳定性,并对其互补性决定区(CDR)-H2进行修改,以增强其与Protein A填料的结合,使之稳定性和可操作性快速提高。由于实验中表征数十种scFv抗体片段,蛋白稳定性难以设计,因此,样品量小的高通量分析 (<300 μg/scFv) 作为预测蛋白与Protein A填料的结合以及蛋白热稳定性的替代方法取得良好的效果。作者针对此类难以实现应用化的抗体分子,进行了更为针对化的设计与筛选方法的试验,从而允许开发更为多样化的抗体用于临床应用。
实验方法
作者通过噬菌体和酵母筛选分理处抗EphA2抗体,在过表达EphA2的细胞系中表现出强烈的内化作用,但其偶联为纳米颗粒过程不稳定,且与Protein A结合差。因此,作者设计一个耐高温抗体变异体D2-1A7,被亚克隆到带有His标签的载体上,利用Expi293系统瞬时表达,使用4000 g,对细胞进行离心,收集可溶性scFv备用。加入样品前,96孔 Protein A HP Multitrap板使用1×PBS缓冲液预清洗,用含有250 μg蛋白的上清加载到96孔 Protein A HP Multitrap板中,加入600 μL的1×PBS,以及200 μL 0.1 M乙酸进行洗脱,室温孵育几分钟后,100 g,离心2 min,加入20 μL 1 M Tris, pH 8.0以中和scFv。
放大培养:培养1L 293F细胞,转染一周后,通过4000 g离心收获细胞,上清液通过0.22 μm滤膜过滤。过滤后的上清加载到预先用PBS缓冲液平衡的MabSelect亲和层析柱中,使用洗杂缓冲液(PBS,500 mM NaCl)进行洗涤,以减少非特异性的相互作用。洗脱缓冲液为pH 3.2,20 mM柠檬酸钠缓冲液,洗脱1 h,洗脱组分立即使用1 M Tris中和至pH 6.0,并用0.2 μm滤膜过滤。
与Protein A亲和层析柱结合能力测试实验:
收获的细胞上清液加载到MabSelect亲和层析柱上,流速500 cm/h,停留时间3 min,直到穿透为10%,此实验结合缓冲液为1×PBS,洗脱缓冲液为pH 3.2,20 mM柠檬酸钠缓冲液。
脂质体纳米颗粒纯化:
脂质体纳米颗粒制备后,使用Sephadex G-75凝胶层析柱进行纯化,缓冲液组分为5 mM HEPES,144 mM NaCl,pH 6.5,得到的脂质体平均尺寸为100-110 nm。
scFv与脂质聚合物进行偶联,偶联过程过量的半胱氨酸通过Sephadex凝胶过滤层析柱进行去除,使用1 mM EDTA,140 mM NaCl,pH 6.0的5 mM柠檬酸盐缓冲液作为流动相。单链偶联物通过加入脂质聚合物mal-PEG-DSPE进一步偶联成scFv-PEG-DSPE。
使用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱将scFv-PEG-DSPE置换到17%葡萄糖,pH 5.7的20 mM柠檬酸缓冲液中。将其与Dil5-SM脂质体混合,混合物加热至60℃,并搅拌30 min。冰上降温后,将样品加载到Sepharose CL-4B凝胶过滤层析柱中进行最终的分离,得到scFv连接脂质体。
作者共筛选了22种scFv变体,经过稳定性测试、Protein A填料的结合测试,以及体外、体内生物和药代动力学分析,最终确定了scFv-3变体作为靶向治疗的纳米颗粒抗体片段。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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填料筛选板 | 28903133 | Protein A HP MultiTrap | 96孔 |
填料 | 17519901 | MabSelect | 25 mL |
填料 | 17005001 | Sephadex G-75 | 100 g |
填料 | 17003201 | Sephadex G-25 Fine | 100 g |
填料 | 17015001 | Sepharose CL-4B | 1 L |