作者：ThomasWeigel et al
发表日期：2019年月6日1日
发表期刊：Journal of Chromatography B
研究背景
流感病毒(IV)由于基因转移和漂移引起的高度变异性仍然对人类构成威胁。尽管全球每年大约生产15亿剂季节性流行病疫苗和大约64亿剂大流行病疫苗，但生产主要基于鸡产蛋的过程，而从蛋中分离菌株到制剂存在时间滞后以及在禽类易引发大流感导致产蛋母鸡种群减少，从而导致含胚鸡蛋短缺的风险。
流感疫苗主要包括三价和四价疫苗。IV是一种膜包膜病毒，在膜表面插入了几种蛋白。血凝素(haemagglutinin)是研究得最少的的免疫原性蛋白质，主要负责IV的高度可变性和多样性，这使得IV的纯化与高纯度相结合需要下游加工的艰巨任务。层析工艺已成为疫苗纯化的具有成本效益且可扩展的工具。一般来说，降低DNA污染水平提出了最高的挑战。到目前为止，基于HIC的过程很少用于病毒纯化。这不仅是因为应用了高盐浓度，这可能会影响病毒的完整性或导致沉淀，还因为其操作条件的复杂性，以及缺乏流程优化的预测模型而需要广泛的筛选研究。尽管如此，HIC是制备生物化学中在速度和分辨率方面最强大的方法之一，同时仍然是一种具有良好容量的相当温和的技术。
在这项研究中，通过筛选多种不同的HIC树脂、盐类型和盐浓度来评估纯化甲型和乙型流感病毒颗粒的选择。在更大的色谱规模上进一步优化和表征选定的参数。最后，将优化的HIC转移到两步色谱下游工艺中，以纯化澄清、灭活、浓缩的IV收获物。我们展示了AEC和HIC的组合用于IV的纯化，总蛋白质和DNA的污染水平符合欧洲药典标准。
实验方法
本研究选择了以下三种 IV 毒株：A/Puerto Rico/8/34, H1N1 (A/PR), A/Wisconsin /67/2005, H3N2 (A/Wis)和 B/ Malaysia/2506 /2004 (B/Mal)，病毒株用贴壁MDCK细胞在GMEM培养基培养。使用 5 μm 和 0.65 μm滤器依次过滤收集培养液。 使用β-丙内酯对病毒进行化学灭活。 随后0.45 μm (截留分子量750 kD)中空纤维膜柱浓缩并储存在-80°C备用。
未透析的病毒材料(A/PR)用浓盐溶液调节至测试的盐析浓度，以确定临界病毒聚集浓度(CAC)。通过使用动态光散射测量装置监测粒度分布来检测聚集。96孔板进行半高通量筛选：每个孔装有300 μL下列不同疏水填料，根据得到的不同盐类型(硫酸铵 、柠檬酸三钠)，将滤板的每个孔用400 μL水和400 μL上样缓冲液平衡两次，平衡缓冲液中含有一定浓度的氯化钠或氯化镁。样品缓冲液为150 mM NaCl 和 20 mM Tris，pH 7.4。将400 μL条件化病毒材料加入每个孔中，1300 rpm 混合15分钟，1200 g离心3分钟。进行三次洗涤，随后，使用含有150 mM NaCl 和20 mM Tris (pH 7.4)的洗脱缓冲液进行四次洗脱步骤。对于每个洗脱步骤，每孔加入400 μL洗脱缓冲液，1300 rpm，5—10分钟，1200 g离心3分钟。所有混合均用热混合器进行。收集上样、洗涤和洗脱步骤的组分，并用 14,000 Da 截止透析膜对50 mM NaCl、20 mM Tris、pH 7.4进行透析4°C 过夜。病毒颗粒定量通过 HA 分析进行，DNA通过Quant-iT™ PicoGreen®分析进行定量。
首先，AEC流穿模式被用作降低DNA污染水平的步骤然后选择HIC步骤作为病毒捕获步骤，以进一步除去DNA和蛋白质。5 mL AEC HiTrap™ Capto Q®柱用500 mM NaCl、50 mM Tris，pH 7.4平衡。病毒材料相应地进行调节，5 mL/min进样，用2M NaCl、50 mM Tris、pH 7.4洗脱杂质。基于散射光信号收集病毒颗粒。将AEC 流穿物调节至1.063 M (NH4)2SO4、0.41 M NaCl、50 mM Tris、pH 7.4，5 mL/min 上样到5 mL PPG-600M柱。用150 mM磷酸钠、50 mM Tris、pH 7.4以1.0 mL/min的线性梯度进行洗脱。基于散射光信号在洗脱液中收集病毒颗粒。
使用14,000 Da或3500 Da透析膜透析除盐，病毒颗粒定量通过HA分析进行，DNA通过Quant-iT™ PicoGreen®分析进行定量。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28926978 | HiScreen Capto Q | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17531610 | Capto Q | 25 mL |
