作者：Keven Lothert et al
发表日期：2020年月8日5日
发表期刊：Journal of Biotechnology
研究背景
在目前用于基因治疗和疫苗的病毒载体中，重组痘病毒具有较大的包装容量和良好的安全性和有效性。这些病毒载体的一个例子是Orf病毒(ORFV)，它是痘病毒科副痘病毒属的成员。它包含一个线性双链DNA基因组。长140 kbp，是一种有包膜的卵形病毒，大小约为260 nm × 160 nm。外壳被一个螺旋状的特征性小管状结构包围，类似于羊毛球。
此前已有成功使用减毒ORFV生成具有多种修饰的不同重组体且能够预防各种传染性病毒疾病的报道。其他ORFV毒株也成功用于生产重组疫苗，灭活的ORFV在不同的临床前模型中显示出免疫调节特性。Orf病毒已成为保护性重组疫苗和溶瘤治疗的有前途的工具。然而用于生产Orf病毒的合适方法(包括上游和下游)非常有限。捕获病毒颗粒的最有前途的色谱方法是空间排阻或耐盐阴离子交换膜色谱，将空间排阻色谱与随后的Capto Core 700树脂或疏水相互作用膜色谱结合作为二级色谱步骤，实现了高达76%的总体病毒回收率。空间排阻膜和Capto Core 700组合可以完全去除细胞蛋白质并将宿主细胞DNA去除率高达82%。
实验方法
反复冻融破坏细胞释放病毒，上清液在4°C和6000 × g下离心10分钟。 澄清的病毒悬浮液用于后续色谱步骤。SXC仅作为捕获步骤进行。使用标称孔径为1 μm的再生纤维素膜作为固定相。将膜冲压成13或24毫米的圆盘，并分别组装到直径为13毫米或25毫米的不锈钢过滤器支架中。对于每个器件，堆叠了10个膜层，为13毫米器件提供了13.3平方厘米(约0.09毫升)的总表面积，为24毫米膜提供了45.2平方厘米(0.32毫升)的总表面积。首先，使用PBS或20 mM TRIS-HCl在7.4的pH值下平衡膜叠层，其中包含8%聚乙二醇(PEG) 8000。TRIS 缓冲液另外补充有180 mM NaCl。用PBS或 20 mM TRIS-HCl缓冲液(pH 7.4，180 mM NaCl)调节澄清的病毒收获物，该缓冲液含有合适的PEG浓度以满足平衡缓冲液的标准。根据使用的膜体积，使用10 mL或150 mL超级定量环上样。上样后，用平衡缓冲液(至少 30 倍柱体积)洗涤柱子，最后用PBS或 20 mM TRIS-HCl 缓冲液pH 7.4 (不含 PEG，但补充有0.4 M NaCl)洗脱病毒。每次色谱实验都使用一叠新的膜。为了表征SXC性能，13 mm过滤器支架使用PBS缓冲液以0.5 mL/min的流速运行。这些运行以 3 mL/ min的流速进行以减少处理时间。
第二步精细纯化，Capto Core 700，使用1 mL预装柱在流通模式下进行了测试。调整SXC纯化的材料以满足平衡缓冲液的条件，分别为20 mM TRIS-HCl pH 7.4和180 mM NaCl，上样后并用平衡缓冲液洗涤后，使用相同缓冲液中并含有 2 M NaCl洗脱结合材料，流速为1 mL/min。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17548115 | HiScreen Capto Core 700 | 1 × 4.7 mL |
| 填料 | 17548101 | Capto Core 700 | 25 mL |
