作者：Keven Lothert et al
发表日期：2020年月8日5日
发表期刊：Journal of Biotechnology
研究背景
尽管医学研究取得了重大进展，但新发传染病（EIDs）爆发的频率正在增加。在过去二十年中，出现了来自严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、寨卡病毒、H5N1和H1N1流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、埃博拉病毒（EBOV）、拉沙病毒（LASV）和尼帕病毒（NiV）的等疾病大流行。
疫苗接种是传染病控制的核心，但传统的开发方法不适合对新威胁做出快速反应，从发现到获得许可平均需要10年以上。蛋白质亚基、核酸（DNA 和 RNA）、复制和非复制载体以及病毒样颗粒疫苗在基因组发表后的几个月内都显示出对 SARS-CoV-2 的临床前疗效，这些候选疫苗主要集中在“刺突”融合蛋白作为靶免疫原。亚单位疫苗特别适合分子表征和合理设计，亚单位疫苗生产是可扩展的，可以设计和配制抗原以增强热稳定性，降低部署成本以提高疫苗的可负担性和可及性。合理的抗原设计策略已经成功地用于临床上如RSV和HIV等，但这些方法通常依赖于详细的结构信息，使它们不适合新型EID的通用应用和快速动员。本文设计了一种称为“分子钳”的异源糖蛋白基序，它有助于病毒融合蛋白的稳定和纯化。
实验方法
分子钳结构域是通过将编码HIV Env蛋白的gp41子结构域的部分序列连接到GP外域而产生的，GP外域通过柔性接头（EBOV GPΔMLD：相连。使用试剂盒从细菌培养物中提取质粒DNA，并转染到expiCHO细胞中进行培养。在转染后7天收获悬浮培养物，然后通过以5000×g离心澄清上清液，然后通过0.22μm过滤器过滤灭菌。在与分子钳型特异性单克隆抗体使用400 mM NaCl PBS洗涤缓冲液和二乙胺洗脱缓冲液（5 mM EDTA，100 mM Tris，400 mM NaCl，20 mM二乙胺，pH 11.5）进行洗脱，使用的层析柱是HiTrap NHS-activated column，并且将特异性结合分子钳的抗体偶联到此预装柱上进行层析分离。柱洗脱馏分以1 M Tris pH 6.8的1：1 （v/v）比中和，浓缩，缓冲液交换至PBS。使用纳米滴分光光度法定量蛋白质浓度。
纯化蛋白质的低聚状态通过体积排阻色谱（SEC）测定，使用经标准品校准后的Superose 6 Increase 10/300 GL的柱子评估寡聚化。经分子筛精细纯化后的样品用于后续结构解析和挑战试验。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17071601 | HiTrap NHS-Activated HP | 5 × 1 mL |
| 预装柱 | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 24 mL |
