作者:Patricia Pereira Aguilar et al
发表日期:2020年6月28日
发表期刊:Journal of Chromatography A
研究背景
Sarbecovirus从蝙蝠向人类的直接外溢,仍然可能引起新的暴发或泛流行,对公共卫生构成威胁。冠状病毒的不断变异,使得疫苗的更新总是比不断进化的病毒晚一两个步骤。因此,需要一种能够产生“广泛保护”的泛冠状病毒疫苗来应对未来新出现的沙贝病毒感染的威胁。泛冠状病毒疫苗可以针对冠状病毒中保守的刺突蛋白和特定区域进行设计,例如针对病毒中的受体结合结构域(RBD)设计。RBD与人类细胞上的ACE2受体蛋白结合,并被人体一些最有效的感染阻断抗体靶向。一般情况下,B细胞只识别一种病毒的RBD,且结合很弱。一类新的冠状病毒疫苗有蛋白质组成,这些蛋白质能自我组装成足球形的纳米颗粒,上面可以镶嵌点缀多种变异病毒的的保守spike或RBD,称之为马赛克纳米颗粒疫苗。但当一个B细胞在镶嵌纳米颗粒上识别出不止一个RBD时,它就会紧紧地结合在多个病毒物种的保守区域上,触发B细胞繁殖并产生强大的免疫反应。近来的研究已证明马赛克RBD纳米颗粒疫苗可诱导产生广谱中和抗体,针对异源病毒感染可以提供比以往二价或多价苗更好的保护。然而,其潜在的免疫学基础有待阐明。近日,中科院微生物研究所高福院士/戴连攀研究员团队在Cell Reports上发表研究论文,该项工作主要基于单细胞测序和抗体库研究,发现马赛克纳米颗粒能诱导产生针对不同沙贝冠状病毒谱系保守表位的免疫优势抗体,揭示出马赛克纳米颗粒疫苗诱导广谱抗体应答的免疫学基础 。
实验方法
研究团队首先制备了一种以2,4-二氧四氢蝶啶合酶(lumazine synthase, LuS)正二十面体作为支架的马赛克自组装纳米颗粒,以展示来自不同的沙贝冠状病毒受体结合域(receptor-binding domain, RBD) 。
基因合成与质粒构建:Spy tag 003-RBD(原型)表达构建体由MERS-CoV S蛋白的信号肽序列(S蛋白残基1-17)、spy tag 003、(GSG)3间隔区、SARS-CoV-2 RBD序列(氨基酸331-529)和C-末端六组氨酸标签(HHHHHH)组成。这些构建体针对哺乳动物细胞进行密码子优化,由外部公司Genewiz合成,然后克隆到pCAGGS载体中。ELISA中使用的SARS-CoV-2 RBD(原型)构建体具有与上相同的构建,只是它不包含spy tag 003序列。其他Sarbecovirus毒株:SARS-CoV-2 (Beta), SARS-CoV-2 (Delta), SARS-CoV-2 (BA.4/5), RaTG13, Pangolin Guangxi P4L, 以与SARS-CoV-2(原型)相似的方式构建。Spy catcher 003-LuS表达构建体由spy catcher 003、(GSG)3间隔区、LuS序列、GSG和C末端六组氨酸标签(HHHHHH)组成。该构建体由Genewiz合成后并进一步克隆到大肠杆菌载体pET21a中。
Spy tag 003-RBD的表达和纯化:简言之,将这些质粒瞬时转染到EXPI293F细胞中用于蛋白表达。使用His excel HP 5ml柱(Cytiva)通过Ni亲和层析纯化上清液。将得到的洗脱液浓缩并使用置换到10mM PBS(pH 7.2)组成的缓冲液中,在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 凝胶柱(Cytiva)进行精纯进一步纯化。通过SDS-PAGE分析目标峰的级分,随后使用超滤管离心柱(30kDa截留值)浓缩。
Spy catcher 003-LuS nanoparticles纳米颗粒的表达与纯化:将Spy catcher 003-LuS质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中用于蛋白表达。细胞在37℃ 下在含有100mg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中培养。当培养物的OD600值达到0.6–0.8时,用1mM IPTG在20℃下诱导细胞20小时。收集细胞并使用低温超高压细胞破碎仪裂解。使用高速离心收集上清液,并使用HisTrap HP 5ml柱(Cytiva)纯化。将洗脱的纳米颗粒浓缩并用HiLoad 10/300 Superose 6凝胶柱(Cytiva)在由10mM PBS(pH 7.2)组成的缓冲液中进一步纯化。将含有纳米颗粒的组分级分浓缩并保存在-80℃。
RBD-共轭纳米粒子的制备:将纯化的纳米颗粒与100倍摩尔过量的纯化的Spy tag 003-RBD(用于产生同型纳米颗粒的单独RBD,用于产生马赛克和鸡尾酒纳米颗粒 的RBD或同型纳米颗粒的等量组合)混合。使用HiLoad 10/300 Superose 6凝胶柱(Cytiva)在由10mM PBS(pH 7.2)组成的缓冲液中将缀合的纳米颗粒与RBD分离。通过SDS-PAGE分析对应于结合的纳米颗粒的级分,浓缩并储存于-80℃。
接着进行小鼠免疫,通过疫苗免疫的血清,对一系列沙贝冠状病毒(clade 1a,1b和3)假病毒中和抗体水平评价,发现马赛克纳米颗粒可诱导产生更高的交叉结合与中和抗体。作者又选择了代表性优势抗体M2-7 ,进行抗体表位竞争实验。
M2-7 Fab 抗体的制备:将抗体的可变区与小鼠IgG 2A恒定区的编码序列连接,并进一步克隆到哺乳动物表达载体pCAGGS中。将成对的全长H链和L链基因共转染至EXPI293F细胞中用于抗体表达达。为了产生M2-7 Fab,用木瓜蛋白酶消化IgG,并用protein A亲和柱(Cytiva)进一步纯化,然后用Superdex 200 Increase 10/300 GL column柱精纯纯化。
通过RBD1-8类表位,mAbs和 hACE2的竞争实验,发现一种隐藏的保守表位RBD-8,能够与所有沙贝冠状病毒结合,具有很高的亲和力,并且能够中和各种沙贝冠状病毒。进一步使用冷冻电镜解析M2-7与RBD和hACE2的复合物结构,发现M2-7与不同组(进化枝)沙贝病毒的RBD结合足迹具有一定程度的保守性,这表明马赛克纳米颗粒扩大了B细胞对沙贝病毒不同分支所共有的共同表位的识别,从而为其与多种沙贝冠状病毒的广谱结合活性提供结果基础。
推荐产品信息
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预装柱 | 17524801 | HisTrap HP | 1 × 5 mL |
预装柱 | 29323952 | HiLoad 16/600 Superose 6 pg | 120 mL |
预装柱 | 17040303 | HiTrap Protein A HP | 5 × 5 mL |
预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 24 mL |
Reference
Mosaic RBD nanoparticle elicits immunodominant antibody responses across sarbecoviruses