作者：Ana Francisca Dias Gomes Candeias
发表日期：2018年10月
发表期刊：Thesis to obtain the Master of Science Degree in Biological Engineering

研究背景

外泌体囊泡中包含外泌体和微囊泡等异质混合物，是细胞间进行信号传导的信使。它们在单克隆抗体的产生过程中扮演的角色还不太清楚，但它们是一种主要的过程相关杂质。在产生曲妥珠单抗的CHO-S菌株中，对培养液离心后检测到每毫升培养液中有2.2 × 1011个外泌体颗粒，颗粒粒径在30-300 nm之间。接着通过一个两步层析技术从上清中分离不同类型的细胞外囊泡。第一步采用多模式层析，流穿液中颗粒回收率在45.8%，同时通过捕获的方式将一些较小的杂质进行了去除。接着使用肝素柱对不同的亚群进行了分离，所得收率在45.8%以上。分离了两种不同的细胞外囊泡群（74.1% 在流穿液中，25.9% 在洗脱液）。

经典的外泌体标记物无法通过已有的标准进行分类，新型的层析方法使我们可以更好地了解外泌体，是传统分离方式的一个有效替代。不同群体中不同特征蛋白质的鉴定证实了这些囊泡的复杂性，并且表明它们的异质性和数量取决于细胞类型、收获时间和压力因素。

实验方法

1. 细胞培养上清预处理
   将培养液用0.1 %的叠氮化钠处理，并在4 ℃条件下于1000 g离心30 min。收集含外泌体的上清，弃沉淀。上清液用核酸酶在27℃下混匀处理2 h。采用ÄKTA pure 25 M2设备，检测280、260和214nm的紫外吸收。
2. Capto Core 700多模式层析
   用0.8 μm的滤膜过滤用核酸酶处理后的上清，然后上Capto Core 700柱子（XK16/20，柱体积3.6 mL），所用buffer A（50 mM HEPES，pH 7.2），Buffer B（5 % of 50 mM HEPES，2 M NaCl，pH 7.2）样品为140 mL用核酸酶处理并过滤过的细胞培养上清液。
3. Capto™ Heparin亲和分离
   经Capto™ Core 700分离后，取20 mL流穿液，上Capto Heparin亲和柱（XK 16/20柱子，柱体积5.6 mL）。所用平衡buffer为buffer A加5 %的第一步层析所用buffer B，洗脱buffer 为5 %到100 %的buffer B，线性洗脱。

产品信息

Reference
Candeias, Ana Francisca Dias Gomes. "Separation of CHO-derived vesicles through multimodal and heparin affinity chromatography." (2018).