作者:Ana Francisca Dias Gomes Candeias
发表日期:2018年10月
发表期刊:Thesis to obtain the Master of Science Degree in Biological Engineering
研究背景
外泌体囊泡中包含外泌体和微囊泡等异质混合物,是细胞间进行信号传导的信使。它们在单克隆抗体的产生过程中扮演的角色还不太清楚,但它们是一种主要的过程相关杂质。在产生曲妥珠单抗的CHO-S菌株中,对培养液离心后检测到每毫升培养液中有2.2 × 1011个外泌体颗粒,颗粒粒径在30-300 nm之间。接着通过一个两步层析技术从上清中分离不同类型的细胞外囊泡。第一步采用多模式层析,流穿液中颗粒回收率在45.8%,同时通过捕获的方式将一些较小的杂质进行了去除。接着使用肝素柱对不同的亚群进行了分离,所得收率在45.8%以上。分离了两种不同的细胞外囊泡群(74.1% 在流穿液中,25.9% 在洗脱液)。
经典的外泌体标记物无法通过已有的标准进行分类,新型的层析方法使我们可以更好地了解外泌体,是传统分离方式的一个有效替代。不同群体中不同特征蛋白质的鉴定证实了这些囊泡的复杂性,并且表明它们的异质性和数量取决于细胞类型、收获时间和压力因素。
实验方法
- 细胞培养上清预处理
将培养液用0.1 %的叠氮化钠处理,并在4 ℃条件下于1000 g离心30 min。收集含外泌体的上清,弃沉淀。上清液用核酸酶在27℃下混匀处理2 h。采用ÄKTA pure 25 M2设备,检测280、260和214nm的紫外吸收。 - Capto Core 700多模式层析
用0.8 μm的滤膜过滤用核酸酶处理后的上清,然后上Capto Core 700柱子(XK16/20,柱体积3.6 mL),所用buffer A(50 mM HEPES,pH 7.2),Buffer B(5 % of 50 mM HEPES,2 M NaCl,pH 7.2)样品为140 mL用核酸酶处理并过滤过的细胞培养上清液。 - Capto™ Heparin亲和分离
经Capto™ Core 700分离后,取20 mL流穿液,上Capto Heparin亲和柱(XK 16/20柱子,柱体积5.6 mL)。所用平衡buffer为buffer A加5 %的第一步层析所用buffer B,洗脱buffer 为5 %到100 %的buffer B,线性洗脱。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
---|---|---|---|
预装柱 | 29400461 | HiTrap Capto Core 700 | 1 × 1 mL |
填料 | 17548101 | Capto Core 700 | 25 mL |
填料 | 17546201 | Capto Heparin | 25 mL |
空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |