作者：Naohiro Seo et al.
发表日期：2022年1月
发表期刊：Journal of extracellular vesicles

研究背景

各种各样的细胞在生长过程中都会释放细胞外囊泡，这些细胞外囊泡的直径范围从50 nm-2000 nm不等。不同直径的细胞外囊泡具有不同的功能及活性。细胞外囊泡的结构和特点使其可以用于药物开发过程中。本文介绍了一种可以用于大规模的细胞培养上清中的细胞外囊泡的分离方法，同时经过性质和功能性鉴定，区分了功能性外泌体和一些体积较大的微囊泡。

实验方法

1. 通过TFF超滤和DEAE阴离子交换层析分离外泌体
   小鼠的CTLs和T helper细胞使用RPMI-1640培养基及10%提前去除外泌体的血清进行培养，培养后10,000 g离心20 min去除细胞收集上清，之后用0.45 μm和0.22 μm的滤膜过滤上清以去除细胞碎片及聚集的蛋白杂质。滤后的细胞上清使用750 kD中空纤维膜柱进行浓缩，浓缩20倍后使用PBS进行洗滤，洗滤后的样品使用DEAE FF阴离子层析柱进行纯化。使用50mL的 DEAE FF层析柱对4 L细胞培养上清进行纯化，纯化过程使用10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.4 平衡，上样后用0.15 M-0.8 M的NaCl进行线性梯度洗脱，洗脱后的外泌体直接被置换到低盐溶液中，（10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.4）。
   结果显示在线性洗脱过程中，通过组分收集共收集到2个组分，Fr20和Fr26，超滤浓缩及阴离子交换两步纯化总回收率约66.4%，高于使用超离方法的回收率（约45%）。经过后续功能的鉴定，发现Fr20 对肿瘤的清除，抑制肿瘤转移等方面优于Fr26。
2. DEAE阴离子交换不同盐浓度洗脱不同群组的外泌体
   为了鉴定DEAE不同盐浓度洗脱的外泌体在功能上的差异，取含有4×1012颗粒数的细胞培养上清进行DEAE FF的阴离子交换层析，洗脱过程使用0.3 M NaCl和0.5 M NaCl直接进行步级洗脱得到两个洗脱组分，并进行后续的组分鉴定。
3. 不同群组的外泌体的性质鉴定
   经过NTA计数，0.3 M低浓度盐洗脱组分（L-S）中得到颗粒2×1012个，0.5 M高浓度盐洗脱组分中（H-S）中得到颗粒1.5×1012个。总的回收率超过87%。通过BSA蛋白定量计算整体纯化过程中蛋白杂质的去除率可达99.7%，纯化效果明显。
   通过电镜鉴定不同组分中收集到的样品的形态，同时对比通过超离得到的样品，结果发现超离得到的外泌体样品中颗粒大小相对均一，但可以发现不同形态的颗粒，通过DEAE FF层析获得的L-S组分中的颗粒大小均已，形态主要为球形，而H-S组分中的颗粒大小不一，形态也主要是球形。
   通过NTA鉴定不同组分中的颗粒粒径，结果发现H-S中的颗粒粒径和超离得到的颗粒粒径相似，而L-S中的颗粒粒径明显较小。之后对不同组分中的颗粒进行了后续的研究，发现 L-S组分中富含各种外显蛋白，包括晚期内切蛋白，rab家族相关蛋白，干扰素家族蛋白等的功能性外泌体，具有预防肿瘤转移的活性，而H-S组分主要是一些微囊泡，包括DNA，核心组蛋白，核糖体蛋白或功能位置的富含GC的miRNA分子，易被甘露糖受体阳性的库普弗细胞吞噬。

产品信息

Reference
Seo N, Nakamura J, Kaneda T, et al. Distinguishing functional exosomes and other extracellular vesicles as a nucleic acid cargo by the anion-exchange method. J Extracell Vesicles.
2022;11(3):e12205.