作者：Raghavendra Upadhya et al.
发表日期：2020年8月
发表期刊：Journal of extracellular vesicles
研究背景
来源于人的诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）的神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植，在脑损伤或疾病后的修复中显示出良好的前景，但安全性问题阻碍了其临床应用。使用来自HiPSC-NSCs的纳米大小的细胞外囊泡（EVs）似乎是一种更安全的替代方法，因为它们可能具有与NSCs相似的神经修复特性，并且可以作为自体或异体产品进行非侵入性给药。然而，迫切需要可靠的方法来分离、表征和测试EVs的生物学特性。
本篇通过阴离子交换色谱（AEC）和尺寸排阻色谱（SEC）联合的方法从HiPSC-NSCs中分离的EVs，并研究其miRNA和蛋白质的特征以及生物活性。AEC和SEC促进了具有完整亚显微结构且表达CD9、CD63、CD81、ALIX和TSG 101的EVs的分离。小RNA测序、蛋白质组学分析、通路分析和miRNA及蛋白的选择验证表明，EVs富含参与神经保护、抗凋亡、抗氧化、抗炎、血脑屏障修复、神经原性和A β 还原活性的miRNA和蛋白。此外，EVs包含能够促进突触发生、突触可塑性和更好的认知功能miRNAs和/或蛋白质。
使用体外巨噬细胞测定和癫痫持续状态小鼠模型的研究证实了EVS的抗炎活性。此外，鼻内给药EVS导致几乎所有成年大鼠和小鼠脑区的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞渗入EVs，并增强海马神经发生。因此，可以从HiPSC-NSC培养物中分离含有与脑修复相关的miRNA和蛋白质的生物活性EVs，使其成为治疗神经退行性疾病的合适生物治疗物。
实验方法
将含有EVs的条件培养基在1811 g下低速离心10分钟，然后通过0.22 µm过滤器过滤以除去细胞碎片和较大的悬浮颗粒。然后使用10 kDa超滤膜装置将大体积的截留液进行5 – 7倍浓缩。
使用1.5 × 12 cm层析空柱，装填10 mL Q Sepharose Fast Flow填料，并用100 mL平衡缓冲液平衡柱子。
将过滤浓缩后的条件培养基加载到Q Sepharose Fast Flow层析柱后，用含50 mM Tris , 1000 mM NaCl，pH 8.0的洗脱液进行洗脱。流速为1 mL/min，收集EVs洗脱组分。
将AEC收集的EVs组分合并后，用10 kDa的超滤膜浓缩后，过25 mL 的 Sephacryl S-500 High Resolution的SEC柱。流动相为50 mM phosphate buffer和200 mM NaCl（pH 7.0） 。不同大小的EVs在SEC上被分开，1 mL/min的流速进行收集后，进行浓缩并保存在−20 °C，以进行后续生物活性研究。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28936543 | HiPrep Q FF 16/10 | 1 × 20 mL |
| 填料 | 17051010 | Q Sepharose FF | 25 mL |
| 预装柱 | 28935606 | HiPrep 16/60 Sephacryl S-500 HR | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17061310 | Sephacryl S-500 HR | 150 mL |
