作者：Sabine Johnson et al.
发表日期：2018年2月1日
发表期刊：Journal of the International Association of Biological Standardization
研究背景
慢病毒载体 (LV) 已在多项临床试验中用于治疗单基因疾病，例如 β-地中海贫血、Wiscott-Aldrich 综合征和异染性脑白质营养不良 (MLD) 。除了造血干细胞 (HSC) 的离体治疗外，LV 还可以有效地转导树突状细胞 ，因为它们有可能在更大的患者群体中用作疫苗。最常见的慢病毒载体是通过瞬时转染产生的。载体只能在短时间内生产且难以扩大规模。此外，产生的载体中存在 DNA 质粒需要对其进行纯化，从而使下游加工复杂化。随着对大量 LV 的需求增加，需要稳定表达 LV 的包装细胞系。
在这项研究中使用尺寸排阻色谱 (SEC) 纯化慢病毒载体，然后使用 LC-MS/ MS 分析纯化载体中的蛋白质组成，这些纯化载体由用 VSV-G 假型的瞬时生产和用 RDpro 包膜蛋白假型的稳定生产细胞系 STAR 产生。进一步分析了这些蛋白质对使用小发夹 RNA (shRNA) 介导的基因调控的载体生产的影响。结果显示敲低表达对载体生产水平的影响不显着。
实验方法
慢病毒载体通过瞬时转染 HEK 293T 细胞或通过稳定的生产细胞系产生。制备了六种不同的载体样品，对于载体样品制备，将细胞接种在 15 cm 培养皿上。对于载体样品 1- 4 细胞在 24 小时后瞬转。24 h更换培养基后再经后24 小时和 48 小时收集含有上清液的载体。通过超速离心浓缩每个板的上清液至最终体积为900μl。瞬转产生的载体样品浓缩40 倍，而稳转产生的载体浓缩了240 倍。
样品通过 Sephacryl-500-HR 介质填充的XK16/70 柱分离。含有 150 mM NaCl、1 mM EDTA、10 mM Tris-HCl pH 7.4 的 10 种缓冲液用作样品运行缓冲液。对于尺寸排阻色谱法，每柱以 0.8 mL/min 的流速纯化 900 μL 粗载体样品。将总共 8 次运行的 900 μL粗载体样品的空峰级分汇集起来，并使用 slide-A-Lyzer 透析盒（容量 3-12 mL，截留分子量 10000 Da）在3 L 10 mM 碳酸氢铵 (ABC)，pH 8.0 缓冲液体系进行。用 Edwards E2M2 高真空泵将透析过的样品冷冻干燥并重新悬浮在蒸馏水中。使用 BSA 蛋白标准品通过 Bradford Protein Assay对总蛋白量进行定量。用 LC-MS/MS 进行纯化的慢病毒载体表征。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28935606 | HiPrep 16/60 Sephacryl S-500 HR | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17061310 | Sephacryl S-500 HR | 150 mL |
| 空柱 | 28988946 | Column XK 16/70 | 16/70 |
