作者:Cui T, Fakhfakh K et al.
发表日期:2022年月9日
发表期刊:Biotechnology Progress
研究背景
2023年3月,石药集团自主研发的mRNA疫苗(SYS6006) 在中国纳入紧急使用。新冠疫情以来,国内mRNA疫苗的研发及生产技术从无到有、日趋成熟。未来,国内疫苗行业将会如何更好地拥抱mRNA技术呢?下面我们将通过文献来解读mRNA下游纯化工艺的优化。
实验方法
线性化DNA模板的纯化
编码IgG的质粒DNA需要首先通过限制性内切酶线性化处理,才能作为模板转录出mRNA。Q SepharoseTM HP能够将线性化 DNA与较大的宿主基因组 DNA、 质粒 DNA及部分的酶分离。除此之外,作者尝试使用PlasmidSelect Xtra层析柱,在流穿模式(FT mode)下快速分离线性化DNA。作者比较研究了四种不同的线性化DNA纯化路线。经过Q SepharoseTM HP层析、切向流过滤(TFF)的两步法纯化后的mRNA纯度最高,主峰中的纯度可以达到90%。
体外转录 mRNA的纯化
纯化得到的线性DNA模板经过体外转录(IVT)合成后得到粗mRNA产物,主要杂质包括:T7 RNA聚合酶、未使用的5’端帽子结构类似物、残留DNA模板,其他残留蛋白质和游离核苷酸等等。
使用切向流过滤作为第一步,不仅可以置换缓冲液,而且可以快速去除小分子杂质。经过一步切向流过滤后,大多数杂质得到有效去除,可检测到的残留蛋白质杂质仅为T7 RNA聚合酶。
作者还对TFF相关工艺参数进行了探索。首先,作者研究了膜截留分子量(MWCO)对纯化效率的影响,发现100kDa最为合适。接下来,通过测量得到跨膜压(TMP)与超滤透过通量(Flux)之间的曲线关系,确定TMP不能超过 5 psi。最后,研究了样品浓度对Flux的影响,发现1 mg/mL的mRNA浓度可以保证较高的透过通量(>25LMH)。然而,作者发现TFF流程比较耗时,且mRNA损失可能超过30%。未来可以尝试使用Oligo dT亲和层析柱特异性捕获mRNA,以达到初步分离的目的。
层析精纯
在第一步的切向流过滤(TFF)中,经过6倍体积的洗滤后,mRNA粗品中的绝大部分小分子杂质得到去除。剩下的主要杂质为T7 RNA聚合酶(99 kDa)和未消化的大DNA片段等大分子。因此,需要利用层析步骤达到精纯的目的。
首先,作者使用陶瓷羟基磷灰石(CHT typeⅡ)层析填料,额外加入100 mM NaCl, 2 mM CaCl2添加剂,发现通过结合-洗脱模式(B/E mode)可以达到精纯的目的。
为了提高mRNA产物的回收率,作者进一步尝试使用了Capto™ Core 400层析填料,通过流穿模式(FT mode)纯化得到了较纯的mRNA产物。Capto™ Core 400是一种新型的多模式层析填料:首先通过填料外壳(shell)的尺寸排阻效应将不同尺寸大小的分子分开,然后通过核心(core)的多模式配基将入孔的杂质吸附;目的分子尺寸较大率先流穿,从而达到快速分离的目的。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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填料 | 28402401 | PlasmidSelect Xtra | 25 mL |
填料 | 17101401 | Q Sepharose HP | 75 mL |
填料 | 17372401 | Capto Core 400 | 25 mL |