作者：Cui T, Fakhfakh K et al.
发表日期：2022年月9日
发表期刊：Biotechnology Progress
研究背景
2023年3月，石药集团自主研发的mRNA疫苗(SYS6006) 在中国纳入紧急使用。新冠疫情以来，国内mRNA疫苗的研发及生产技术从无到有、日趋成熟。未来，国内疫苗行业将会如何更好地拥抱mRNA技术呢？下面我们将通过文献来解读mRNA下游纯化工艺的优化。
实验方法
线性化DNA模板的纯化
编码IgG的质粒DNA需要首先通过限制性内切酶线性化处理，才能作为模板转录出mRNA。Q SepharoseTM HP能够将线性化 DNA与较大的宿主基因组 DNA、 质粒 DNA及部分的酶分离。除此之外，作者尝试使用PlasmidSelect Xtra层析柱，在流穿模式（FT mode）下快速分离线性化DNA。作者比较研究了四种不同的线性化DNA纯化路线。经过Q SepharoseTM HP层析、切向流过滤（TFF）的两步法纯化后的mRNA纯度最高，主峰中的纯度可以达到90%。
体外转录 mRNA的纯化
纯化得到的线性DNA模板经过体外转录（IVT）合成后得到粗mRNA产物，主要杂质包括：T7 RNA聚合酶、未使用的5’端帽子结构类似物、残留DNA模板，其他残留蛋白质和游离核苷酸等等。
使用切向流过滤作为第一步，不仅可以置换缓冲液，而且可以快速去除小分子杂质。经过一步切向流过滤后，大多数杂质得到有效去除，可检测到的残留蛋白质杂质仅为T7 RNA聚合酶。
作者还对TFF相关工艺参数进行了探索。首先，作者研究了膜截留分子量（MWCO）对纯化效率的影响，发现100kDa最为合适。接下来，通过测量得到跨膜压（TMP）与超滤透过通量（Flux）之间的曲线关系，确定TMP不能超过 5 psi。最后，研究了样品浓度对Flux的影响，发现1 mg/mL的mRNA浓度可以保证较高的透过通量（>25LMH）。然而，作者发现TFF流程比较耗时，且mRNA损失可能超过30%。未来可以尝试使用Oligo dT亲和层析柱特异性捕获mRNA，以达到初步分离的目的。
层析精纯
在第一步的切向流过滤（TFF）中，经过6倍体积的洗滤后，mRNA粗品中的绝大部分小分子杂质得到去除。剩下的主要杂质为T7 RNA聚合酶（99 kDa）和未消化的大DNA片段等大分子。因此，需要利用层析步骤达到精纯的目的。
首先，作者使用陶瓷羟基磷灰石（CHT typeⅡ）层析填料，额外加入100 mM NaCl, 2 mM CaCl2添加剂，发现通过结合-洗脱模式（B/E mode）可以达到精纯的目的。
为了提高mRNA产物的回收率，作者进一步尝试使用了Capto™ Core 400层析填料，通过流穿模式（FT mode）纯化得到了较纯的mRNA产物。Capto™ Core 400是一种新型的多模式层析填料：首先通过填料外壳（shell）的尺寸排阻效应将不同尺寸大小的分子分开，然后通过核心（core）的多模式配基将入孔的杂质吸附；目的分子尺寸较大率先流穿，从而达到快速分离的目的。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 28402401 | PlasmidSelect Xtra | 25 mL |
| 填料 | 17101401 | Q Sepharose HP | 75 mL |
| 填料 | 17372401 | Capto Core 400 | 25 mL |
