作者：Fariha Kanwal et al.
发表日期：2018年8月
发表期刊：Cellular Physiology and Biochemistry

研究背景

自 20 世纪 90 年代发现调控 RNA 元件以来，RNA 已成为基因调控研究的核心角色。对 RNA 相关主题的完整生化分析通常包括结构测定和动态研究，这对 RNA 样品的数量和质量都有严格要求。尽管目前的研究在细胞中过表达 RNA 方面取得一些进展，但体外转录因其简单和广泛的适用性仍是最主要的获得RNA的方法。然而，体外转录反应产生的 RNA 的质量和数量会因多种影响因素而产生差异，这些影响因素包括各组分的浓度和比例、孵育时间和温度。此外，由于核糖酶经常被用于生成均一的 3′和 5′末端，因此转录完成后它们的裂解效率也需要进一步优化，以提高产量和纯度。

转录和核糖酶裂解后的混合物通常需要长时间分离才能产生全长的成熟 RNA。传统上，纯化需要进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea-PAGE电泳），来实现目标 RNA 与 RNAP、DNA 模板、未裂解的前体 RNA、流产转录本和 NTP 的分离。这种方法虽然有效，但也有若干缺点。首先，这一步骤至少需要两天才能完成，显著限制实验速率。其次，洗脱步骤会在凝胶中残留RNA，从而降低总产量。第三，洗脱液通常含有丙烯酰胺，会降低终产物的纯度。urea-PAGE 的替代方法包括标签亲和层析纯化法和基于快速液相色谱法（FPLC）的方法。标签亲和层析方法通常需要一个能被核酸酶裂解的标签（即串联 MS2 标签），该标签可与 his 标记的 MS2 蛋白结合。这种技术可配合额外的凝胶过滤层析（SEC），制备出毫克级结晶质量的中小型 RNA。而较大的目标 RNA（200 nt以上）会大大降低这种技术的效率。另外，目前已有基于 SEC 的方法能在原生条件下有效分离目标 RNA 与反应物和副产物。不过，此类技术需要繁琐的预处理步骤来去除 RNAP 和转录混合液。

为了解决 RNA 分析中的这些难题，研究者提出了一套完整的 RNA 分析优化方案，包括体外转录、RNA 纯化和 SHAPE 化学探针。首先，研究者改进了体外转录方法，优化了转录和核糖酶裂解反应，将目标 RNA（最长 450 nt）的产量提高了近两倍。其次，研究者基于 SEC 的变性纯化方法在保持高产率和高纯度的同时，减少了纯化步骤和总时间。最后，研究者修改了当前的 SHAPE 方案，以提高较大 RNA 构建体 SHAPE 反应的准确性和 SNR。总之，用于生产、分离和化学探测 RNA 的新方案大大提高了 RNA 的产量、纯度和结构分析的可信度，从而使该方案对更广泛的 RNA 分子更加稳健可靠。

实验方法

样品的制备：将RNA 的转录混合物加热至 90℃，持续5 分钟后，立即转移到冰上 5 分钟，然后离心（16,000g ，10 分钟）。取离心后上清液并与含 8 M 尿素和 100 mM NaCl 的 Tris-EDTA 缓冲液按 1:4 的比例混合。上样前的处理是为了去除 T7 RNAP、残留的焦磷酸盐和体外转录过程中形成的聚集物。

样品的纯化：RNA 纯化在 ÄKTA Purifier 100 FPLC 系统（Cytiva）上进行，Superdex 75 和 Superdex 200 层析填料分别装入 890/10 mm 和 XK 16/1000 mm 色谱柱（Cytiva）。纯化使用的缓冲液是含有 8 M 尿素和 100 mM NaCl 的Tris-EDTA缓冲液。先在冷室（4℃）中用说明书中推荐的若干柱体积（CV）缓冲液进行平衡。之后，将处理后的转录混合物上样至平衡后的凝胶过滤层析柱中，以 1 mL/min 的流速进行纯化，收集 2 mL 的馏分。对馏分进行变性尿素-PAGE 分析。合并含有 S-box RNA 的馏分，使用超滤管浓缩至 0.5 mL，用适当的缓冲液洗涤两次，进行化学探针分析。所有实验均在 4℃下进行。

结果表明，在 SEC 柱的上样量范围内，洗脱曲线是一致的。将含有所需 RNA 的收集液合并、浓缩，并使用超滤管将缓冲液交换到适当的条件。用这种纯化方法获得的目标 RNA 纯度大于 99%，不含 NTP、终止转录本和丙烯酰胺污染物。所有过程均使用标准的 FPLC 系统和商品化的 SEC 空柱和填料。使用流速更高的预包装色谱柱还能进一步压缩实验时间。由于基于 SEC 的方案不涉及urea-PAGE，因此不依赖凝胶洗脱也能提高产量。在平行实验中，与传统的 PAGE 纯化方法（4.2 mg/mL）相比，使用SEC纯化的 RNA 产量提高了七倍（31 mg/mL）。

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Reference
Fariha Kanwal, Ting Chen, Yunlon Zhang, Altaf Simair, Cai Rujie, Najam us Sahar Sadaf Zaidi, Xinhang Guo, Xiaolong Wei, Geoffrey Siegel, Changrui Lu; Large-Scale in Vitro Transcription, RNA Purification and Chemical Probing Analysis. Cellular Physiology and Biochemistry 28 August 2018; 48 (5): 1915–1927. https://doi.org/10.1159/000492512