作者：Rita Silva-Santoset al.
发表日期：2017年3月22日
发表期刊：Separation and Purification Technology

研究背景

目前，非病毒基因治疗和DNA疫苗接种在治疗和预防遗传性和后天性疾病方面具有巨大潜力。质粒DNA（pDNA）载体的大规模制造，尤其是下游加工，是将非病毒基因治疗推向临床所需的工艺开发的关键方面之一。为了解决pDNA分子的分离和纯化问题，开发了一种基于多峰色谱的替代和成本有效的方法。特别是，探索了使用阳离子多峰配体（CaptoTM粘附）从大肠杆菌预纯化裂解物中去除RNA杂质并从开放环状（oc）pDNA中分离超螺旋（sc）pDNA亚型的可能性。

研究方法

离心收获菌体，经碱裂解法制备粗提的质粒DNA后。加入70%(v/v)异丙醇，在-20ºC下沉淀2小时，离心弃上清，室温下放置沉淀物干燥过夜。重悬沉淀物用TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)中和后，加入适量的乙酸铵，使pDNA富集液中乙酸铵的浓度达到2.5 M。混匀后，将溶液放在冰上静置15分钟，离心30分钟。回收上清，加入30% PEG-8000含1.6 M NaCl，最终达到10% PEG-8000的浓度。为了使pDNA完全沉淀，将混合物放置在4ºC下过夜，然后离心。弃上清后，将含核酸的微球重悬于1ml TE缓冲液中。

将预处理的样品用含830mM NaCl的TE溶液按照1:12进行稀释，5mL Capto adhere柱子用41.5%缓冲液B平衡层析柱3CV后上样，最后用46%缓冲液B洗脱，收集洗脱液（每1.5mL收集一管）。

分离组分脱盐后以SDS-PAGE方法进行蛋白纯度的检测，HIC-HPLC方法检测样品质量。

质粒在大肠杆菌中表达，样品预处理后经一步多模式填料纯化后产品纯度达到1.3±0.3 % µg gDNA/µg sc pDNA，最终计算一步层析质粒的收率83%，总的收率47%。通过一步多模式层析去除了大量的开环（oc）质粒DNA和RNA。

产品信息

Reference
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1383586616322420