作者：Bo Sun, et al.
发表日期：2013年3月24日
发表期刊：Journal of Bioscience & Bioengineering
研究背景
近年来，在疫苗应用和基因治疗中对药物级质粒DNA的需求一直在增加。在本研究中，开发了一种由碱性裂解、切向流动过滤、阴离子交换色谱纯化、疏水相互作用色谱和尺寸排阻色谱组成的工艺。最终产物符合药物级质粒DNA的要求。染色体DNA含量<1 mg/mg质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳无法检测RNA。此外，蛋白质含量＜2 mg/mg质粒DNA，内毒素含量＜10 EU/mg质粒DNA。该过程按比例放大，从约2 kg细菌细胞浆中产生800 mg药物级质粒DNA。最终质粒DNA的总产率达到48%。因此，我们建立了一种快速高效的药物级质粒DNA生产工艺
研究方法
大肠杆菌发酵：将大肠杆菌DH5a宿主菌株(含有编码HIV核心抗原的6.4 kb质粒)置于500 ml摇瓶中，加入100 mL含50 mg/mL卡那霉素的复合生长培养基 (37°C，230 rpm，12小时)。用95毫升培养基接种两个摇瓶，每个摇瓶含有1000毫升发酵培养基，细胞生长5小时(37°C, 230转/分)。所有培养物(2000毫升)用于接种含有25 L发酵培养基的40 L BioFlo 5000发酵罐。搅拌速度由氧需求量控制。置于Beckman J-6M1中，5020 g离心20分钟，弃去上清。收集的菌体保存在-20°C。
碱裂解：将2000克菌体重悬于16 L的50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0缓冲液中，在4°C搅拌均匀。0.2 M氢氧化钠,1.0% SDS裂解液裂解10分钟。裂解完加入16 L中和缓冲(3 M KAc pH 5.5)，中和30分钟。然后将16升2 M CaCl2直接加入到未澄清的裂解液中，温和搅拌，孵育1小时，直到形成致密的悬浮固体层，1.0 mm滤膜过滤。
TFF切向流浓缩（300 Kda），并去除分子量较小RNA等杂质。
阴离子层析捕获：Q Sepharose XL(BPG100/500)层析柱用0.5M KAc, pH5.5平衡液平衡，平衡完将样品以100ml/min的流速上样至层析柱。用0.6M NaCl, 50mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH8.0将结合在柱子上的RNA去除。最后，用0.6M NaCl, 50mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH8.0将DNA洗脱下来，收集洗脱峰。
精纯1：Phenyl Sepharose 6 FF(XK50/30)用2M (NH4)2SO4 ,50mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH8.0平衡液平衡后，以30ml/min将Q Sepharose XL洗脱液上样至层析柱，收集流穿峰。
精纯2：Sepharose 6 FF(BPG100/950)用20mM PBSTris-HCl pH7.2平衡, 以60ml/min将Phenyl Sepharose 6 FF流穿液上样至层析柱，得到的主峰即为DNA。
用Mini Q柱对产品纯度和回收进行分析，并对产品浓度、染色体DNA、内毒素含量进行测量。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17515801 | HiTrap Q XL | 5 × 1 mL |
| 填料 | 17507201 | Q Sepharose XL | 300 mL |
| 预装柱 | 17135501 | HiTrap Phenyl FF (HS) | 5 × 1 mL |
| 填料 | 17097310 | Phenyl Sepharose 6 FF (HS) | 25 mL |
| 空柱 | 28988953 | Column XK 50/30 | 50/30 |
| 填料 | 17015901 | Sepharose 6 FF | 1 L |
| 预装柱 | 29275878 | Capto HiRes Q | 1 × 1 mL |
