作者：王延亮et al.
发表日期：2011年
发表期刊：Chinese Journal of Biotechnology

研究背景

肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor， HGF) 是一类多功能生长因子，具有刺激血管增生 作用，通过局部肌肉注射携带 HGF 基因的质粒 DNA 可明显促进肢体急性缺血部位新生血管的形成，在 临床上具有治疗缺血性疾病的应用前景Zhang 等对质粒 pUDK-HGF 大规模纯化工艺 248 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2011 Vol.27 No.2 Journals.im.ac.cn 进行了大量研究，工艺成熟，能生产药用级重组质 粒 pUDK-HGF 注射液。其工艺是碱裂解后离心处理 获得澄清碱裂解液，直接用 Q-Sepharose XL 阴离子 交换层析捕获质粒 DNA；再用 Sephacryl S-1000 分 离除去 RNA；用 Source 15Q 对质粒 DNA 进行精 制。随着新填料 plasmidselect 的出现，生产超螺旋 质粒 DNA 的工艺随之更新，因此本文建立新的 pUDK-HGF 纯化工艺，该工艺为碱裂解细菌后，用 绸布滤去细胞碎片等絮凝物，获得碱裂解上清液； 上清液经 300 kDa 超滤柱进行浓缩，获得的浓缩液 经 Sephacryl S-1000 层析柱除去 RNA，然后通过 plasmidselect 层析柱对超螺旋质粒 DNA 进行捕获， 获得高纯度的超螺旋质粒 DNA，再通过琼脂糖凝胶 6BFF 对超螺旋质粒 DNA 进行脱盐；最终采用异丙 醇沉淀质粒 DNA，75％乙醇洗涤，配方溶液重溶获 得产品。

研究方法

Sephacryl S-1000 (GE Healthcare) 填料 1.5 L 装 于 5.5 cm×80 cm 层析柱中 ， 溶液 A (2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 平衡，碱裂解浓缩液以 柱体积的 10％上样，上样结束后溶液 A 洗脱， EC2000 色谱工作站检测 ，收集 DNA 峰。流速为 4.5 mL/min。Plasmidselect (GE Healthcare) 填料 55 mL 装于 2.6 cm×20 cm 层析柱中 ，溶 液 A 平衡，将 Sephacryl S-1000 收集的 DNA 溶液上 样，溶液 A 洗脱 3 个柱体积，溶液 B (0.02 mol/L NaCl，2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脱至基线，溶液 C (0.3 mol/L NaCl，1.7 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脱超螺旋质 粒 DNA。EC2000 色谱工作站检测，收集超螺旋质 粒 DNA。流速为 3 mL/min。

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Reference
https://cjb.ijournals.cn/cjbcn/article/pdf/gc11000247?st=alljournals