作者：Xu-Mei Chen et al.
发表日期：2020年月9日5日
发表期刊：Journal of Biotechnology

研究背景

严重肢体缺血（CLI）是最严重的外周动脉疾病，由于下肢动脉粥样硬化闭塞，会导致残疾和生活质量受损。严重的肢体缺血会导致跛行、溃疡无法愈合、休息时疼痛，一些患者需要截肢。随着DNA重组、基因克隆等技术的逐步成熟，基因治疗这一具有革命性的医疗技术不断发展，改变了单基因遗传病的治疗现状，为肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病等带来了新的选择。pUDK-HGF是一种携带人肝细胞生长因子的质粒，现已被开发为基因治疗药物，且有多个项目进入临床阶段。截至目前，pUDK-HGF作为CLI治疗药物已进入临床Ⅲ期。

研究方法

利用E.coli DH5α strain菌株进行质粒发酵，发酵12h后结束，离心得到的菌体，进行碱裂解，通过浓缩换液得到含质粒的粗品。

通过三步法生产pUDK-HGF质粒

1. 第一步：去除溶液中的RNA
   将含有pUDK-HGF和RNA的浓缩澄清裂解物装载在Sepharose 6 Fast Flow柱（5.5cm×60cm，GE Healthcare）
2. 第二步plasmidselect Xtra纯化超螺旋DNA
   将来自Sepharose 6 Fast Flow的pUDK-HGF部分用PlasmidSelect Xtra柱（5.5cm×8cm，GE Healthcare）
3. 第三部用Source 15Q精纯
   来自PlasmidSelect Xtra的超螺旋pUDK-HGF在来源上进一步纯化15Q柱（7.5cm×4.5cm，GE Healthcare），用浓缩和最终过滤将冷乙醇（3体积）加入到来源15Q的溶液中，pUDK-HGF为以10000g离心30min沉淀并收集。将pUDK-HGF颗粒排出并在干净的罩中空气干燥。湿干pUDK-HGF用配制溶液（包括NaCl、NaH2PO4），并通过无热原过滤0.22μm过滤器，储存于4℃用于检测。
   检测结果为回收率范围为58.27%至66.70%。pUDK-HGF的纯度大于95.8%。

产品信息

Reference
Gram-scale production of plasmid pUDK-HGF with current good manufacturing practices for gene therapy of critical limb ischemia - PubMed (nih.gov)