作者：Xu-Mei Chen et al.
发表日期：2022年10月
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences
研究背景
九香虫（Aspongopus chinensis Dallas）是一种可食用昆虫，同时也是一味传统的中药材。本草纲目中就记载了其药用功效，现代医学也认为九香虫对胃癌、食道癌有一定医效。虽然其抗肿瘤作用早已被观察到，但其血淋巴中的抗肿瘤活性成分尚不清楚。本研究采用超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析和反相高效液相层析相结合的方法，从九香虫血淋巴中分离纯化多肽组分，并以人胃癌 SCG-7901细胞为研究对象，探究了不同分离组分对胃癌SCG-7901细胞增值的抑制作用。最终分离出一种对SCG-7901细胞增值有显著抑制作用的活性多肽。
实验方法
九香虫去除头部、胸部和翅膀后，将它们的身体放入10 ml 注射器中，然后挤压以释放血淋巴。将血淋巴转移至离心管中，在4 ℃下以12，000 g 离心30分钟后，轻轻刮去顶部液体层（含油）。将水溶液层在4℃下以12，000 g 再次离心30分钟，收集上清液用于进一步研究。
用PBS缓冲液1:4的比例稀释九香虫血淋巴，然后离心1小时（12，000 g，4 ℃），收集上清液。将上清液转移至 MWCO 50 kD和MWCO 3 kD 超滤管中离心1–2小时（4500 g，4 ℃）。血淋巴中的成分分为三个部分：>50 KD 、3–50 KD 和 <3 KD。冷冻干燥后，将这些组分重新溶解在1ml PBS中。研究三种组分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用，表明组分Ⅱ（3–50 KD）的抑制率最高。
选用Sephadex G-50 凝胶填料对组分Ⅱ进行凝胶过滤层析。平衡/洗脱缓冲液为：50 mM Tris-HCl (pH 9.0)，紫外检测波长为215。最终组分Ⅱ在凝胶过滤层析中被分出5个峰（Ⅱ- 1_5），随着洗脱被分别收集。将每个级分脱盐，冷冻干燥，并重新溶解在PBS中。研究凝胶过滤层析分离的5个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用，表明级分Ⅱ-3的抑制率最高。
接着，级分Ⅱ-3用 resource Q (6 mL) 强阴离子交换柱进行进一步分离，平 衡 缓 冲 液:50mmol/L Tris-HCl （ pH9.0 ） ； 洗 脱 缓 冲 液:50mmol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl（pH9.0）；以1.5 mL/min流速，50 min-100% B的梯度进行线性梯度洗脱，215nm波长检测，最终分出4个峰（Ⅱ-3_1-4）。研究离子交换层析4个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用，表明级分Ⅱ-3-3的抑制率最高。
最后级分Ⅱ-3-3用RP-HPLC 进一步进行纯化，层析柱： X Bridge C18；平衡缓冲液: 99.9%超纯水+0.1%三氟乙酸（TFA）；洗脱缓冲液: 99.9%乙腈+0.1%三氟乙酸（TFA）；最终分得6个峰（Ⅱ-3-3_1-6）。研究RP-HPLC层析6个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用，表明级分Ⅱ-3-3-5的具有最高的抑制活性。
后续经过质谱鉴定，Ⅱ-3-3-5是一个分子量为2853.3 Da的活性肽，氨基酸序列也同时被测定。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 17004301 | Sephadex G-50 Medium | 100 g |
| 预装柱 | 17117901 | RESOURCE Q | 6 mL |
