作者：Zhang et al.
发表日期：2021年9月
发表期刊：Structure
研究背景
胰高血糖素样肽-1受体 (GLP-1R) 是治疗2型糖尿病和肥胖症的一个主要、经验证的靶点，有许多获批的肽疗法。可口服的小分子GLP-1R激动剂的出现引发了人们对发现和开发新型GLP-1R药物的新兴趣。其中最有希望的是PF 06882961，我们最近报道了这种化合物与活性GLP-1R结合的结构，该化合物在结合袋中具有高分辨率。与大多数Gs蛋白偶联复合物一样，Nb35被用作稳定策略的一部分。在这项研究中，我们使用PF 06882961-GLP-1R，使用DNGas作为独立的稳定技术，检查在不存在Nb35的情况下形成的络合物的稳定性和结构分辨率。此外，我们还将成像后该复合体的结构分辨率与最新探测器技术（Gatan K3或Thermo Fisher Scientific Falcon 4）支持的200或300 kV cryo-EM进行了比较。我们发现，虽然在没有Nb35的情况下G蛋白的动力学增加，但小分子结合区域的分辨率与存在Nb35时观察到的相似。值得注意的是，用200kV Glacios Falcon 4成像的复合物中化合物结合区域的分辨率与Krios-K3或Krios Falcon4成像复合物的分辨率在质量上相似。
实验方法
采用N端Flag标签、C端8×His标签，在sf9昆虫细胞中表达GLP-1R蛋白。收获细胞后将细胞沉淀悬浮在 20 mM HEPES pH 7.4、50 mM NaCl、5 mM CaCl2、2 mM MgCl2 中，辅以蛋白酶抑制剂。通过添加 50 mM PF 06882961 和apyrase (25 mU/ml, NEB) 形成复合物，将悬浮液在室温下孵育 1 小时。使用 0.5% (w/v) LMNG 和 0.03% (w/v) CHS 在 4℃ 下1小时将复合物从膜上溶解。30,000 ×g 下离心 20 分钟去除不溶性物质，上清液在 5 mM CaCl2 条件下与 M1 anti-Flag affinity resin结合。将树脂装入柱中，用 20 个柱体积的 20mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、5 mM CaCl2、5µM agonist、0.01%(w/v) LMNG 和 0.0006%(w/v) CHS 洗涤，然后用含有5 mM EGTA 和 0.1 mg/mL FLAG 肽洗脱目的样品。浓缩样品后用 Superdex 200 Increase 10/300 Column (Cytiva) 对样品进行纯化，提前用 20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、5 µM agonist、0.01% (w/v)MNG 和 0.0006% (w/v) CHS 预平衡柱子。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
