作者：Liao YY et al.
发表日期：2023年12月
发表期刊：Cell Press
研究背景
大麻通过Gi和β-arrestin1信号通路激活大麻素受体1，使机体产生镇痛和情绪调节作用，但同时还产生了不利影响。作者所在团队前期研究发现大麻素受体CB1在杏仁核胆囊收缩素神经元介导的神经环路中调控负性情绪和抑郁，外源性给予大麻，激活大麻素受体CB1可以对抗抑郁，还发现CB1调控疼痛阈值的神经环路，阐明了大麻镇痛的新机制。然而，近几十年来，靶向大麻素受体CB1的小分子药物开发面临着巨大挑战，包括药物滥用的风险以及副作用的控制。大麻素受体CB1属于G蛋白偶联受体（GPCR），通过激活下游Gi/o和β-arrestin（阻遏素）这两类信号来发挥功能。目前研究认为，在以GPCR为靶点的药物开发中，可以通过操控受体选择激活下游特定的G蛋白信号通路或arrestin信号通路，引发不同的细胞级联响应，将治疗作用与副作用分离，从而开发更安全且副作用更小的药物。因此，获得CB1–β-arrestin信号转导复合物结构并阐明选择性机制将是完善大麻素受体CB1成药的一块关键“拼图”。
该团队经过不断优化样品制备和计算方法，获得3.1 Å的大麻素受体CB1和下游信号分子β-arrestin1的冷冻电镜复合物结构，在该复合物中，添加了抗体片段Fab30以增强CB1pp-barr1的稳定性。该电镜结构图清晰地展现了在β-arrestin1结合状态下特殊的CB1配体结合特征，及大麻素受体CB1在Gi蛋白结合状态和β-arrestin1结合状态下的精确空间差异信息，从而理解偏向激活的“开关”。通过理解空间差异信息，可设计G蛋白偏向性或β-arretin1偏向性的合成大麻素，促进大麻素受体CB1激动剂的开发。
实验方法
Fab30的表达和纯化：在大肠杆菌BL21(DE3) 细胞的外周质中表达C端带有9x His标签的Fab30，细胞离心收获，裂解细胞，使用Ni柱进行粗纯，得到的组分使用50 kD超滤管进行浓缩处理，再使用HiPrep 26/10脱盐柱将样品换液至pH 7.5，20mM HEPES，100 mM NaCl缓冲液中。
复合物的组装机纯化：Sf9昆虫细胞培养至2.2×106细胞密度后，用CB1、barr1和GRK2/5三种病毒以相同的倍数分别感染，感染的细胞在27℃下培养48h后离心收获。用pH 7.5，20 mM HEPES、150 mM NaCl，2 mM MgCl2，添加有不含EDTA的蛋白酶抑制剂缓冲液中裂解，加入56 mg/ml Fab30和100 mM FUB，孵育形成复合物。细胞裂解液室温孵育1h，用0.5%(w/v)和1% CHS，4℃下溶解2h，离心后，分离获得上清，用NEB直链淀粉树脂 4℃下孵育1h后，用10 mM麦芽糖洗脱蛋白，用TEV蛋白酶处理。然后使用100 kD超滤管浓缩，浓缩后的料液使用Superose 6 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱，在pH 7.5，20 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM MgCl2，10 μM FUB，0.00075% (w/v) LMNG，0.0002% (w/v) CHS和0.00025% (w/v) GDN缓冲液中精纯，收集复合物部分，浓缩后进行电镜实验。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17508701 | HiPrep 26/10 Desalting | 1 × 53 mL |
| 预装柱 | 17524801 | HisTrap HP | 1 × 5 mL |
| 预装柱 | 28918779 | MBPTrap HP | 1 × 5 mL |
| 预装柱 | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
