作者：Osamu Nureki et al.
发表日期：2020年2月
发表期刊：Nat Commun

研究背景

Argonaute蛋白结合sncRNA引导物以形成RNA介导的沉默复合物，其识别与引导RNA互补的RNA。Argonaute蛋白可分为两个分支，AGO和PIWI。AGO分支Argonautes(AGO) 广泛表达，并结合20-22 nt的sRNA或siRNA，以调节基因表达。PIWI分支Argonautes (PIWIs)结合24-31 nt的与PIWI相互作用的RNA (piRNAs)，形成piRNA诱导的沉默复合物，使转座子沉默并保持动物性腺中的基因组完整性。PIWI蛋白主要在动物生殖系统中表达，对于动物生殖细胞的分化发育至关重要。而PIWI蛋白功能的发挥离不开一类动物生殖细胞特异性小分子非编码RNA—piRNA的参与。PIWI/piRNA复合体通过沉默基因组中的可移动性遗传元件，维持了生殖细胞基因组的稳定性和完整性，同时还可以在转录后水平负调控蛋白编码基因的表达。

实验方法

在OSCs (Cell Lines, ~5.0 × 1010 cells)中表达PIWI蛋白，收获细胞后在buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.3, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, 0.1% NP-40, 4.5 μg/ml aprotinin, 1.4 μg/ml leupeptin, 2.0 μg/ml pepstatin)中重悬，并裂解离心，取上清。

按照说明书操作，将anti-Piwi monoclonal antibody 100 mg与CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow (Cytiva) 10 mg偶联。将上清液与抗Piwi抗体偶联珠在4℃下孵育3.5小时。用buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0、300 mM NaCl、0.5 mM CaCl2、1 mM DTT、10% 甘油和0.1% NP-40)洗涤填料，然后与chymotrypsin (28 μg) (Promega)在 4 ℃下放置18小时，以释放Piwi-piRNA复合物。

将Piwi-piRNA复合物加载到HiTrap Heparin HP (Cytiva)上，用缓冲液 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、200 mM NaCl、1 mM DTT和10% 甘油)平衡，并使用0.2-2 M NaCl的线性梯度洗脱。将洗脱下的Piwi-piRNA 复合物在HiLoad 16/600 Superdex 200 (Cytiva)柱上用缓冲液 (10 mM Tris-HCl pH 8.0、300 mM NaCl、1 mM DTT和10% glycerol)进一步纯化。

产品信息

Reference
Yamaguchi S, Oe A, Nishida KM, Yamashita K, Kajiya A, Hirano S, Matsumoto N, Dohmae N, Ishitani R, Saito K, Siomi H, Nishimasu H, Siomi MC, Nureki O. Crystal structure of Drosophila Piwi. Nat Commun. 2020 Feb 12;11(1):858.