作者：Isha Raj et al.
发表日期：2017年6月
发表期刊：Cell

研究背景

精子和卵子表面之间的识别标志着所有有性生殖生物体生命的开始。受精过程中生殖细胞之间的第一次接触是由卵壳表面介导的。这种特殊的细胞外基质，在哺乳动物中称为透明带 (ZP)，在非哺乳动物中称为卵黄包膜 (VE)，必须被精子识别和穿透，才能发生配子质膜融合。ZP3和ZP2是ZP的两个主要亚基，长期以来一直与哺乳动物卵子和精子之间的初始相互作用有关。特别是，最近的研究表明，ZP2的N末端区域对小鼠和人类的配子识别具有关键性的调节作用。然而，尽管最近在阐明哺乳动物配子融合所必需的质膜接触方面取得了重大进展，但精子上可能的 ZP2 和 ZP3 对应分子的身份仍然难以捉摸。研究人员解析了无脊椎动物卵壳蛋白VERL的结构域重复1-3及其与同源精子蛋白溶素的相互作用的生化、晶体学和突变研究。VERL结合溶素的高正电荷表面的暴露表明，复合物的形成既破坏了卵壳细丝的组织，又触发了它们的静电排斥，从而为精子穿透和融合打开了一个通道。

实验方法

在E.coli中表达目的蛋白，收集的菌体在Buffer (40 mL lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) 包含 60 ku rLysozyme (Merck Millipore)，750 u Benzonase nuclease (Sigma-Aldrich)和1 tablet cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche))中孵育30 min后超声破碎。12,000 g 4℃离心20分钟收集包涵体，37℃下磁力搅拌溶解于100 mL 5 M盐酸胍2-3 h，4℃ 12,000 g离心15分钟澄清。使用10 kDa的SnakeSkin 透析管 (Thermo Fisher Scientific)将上清液在4 ℃下用4 L 羧甲基 (CM)缓冲液 (250 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM MES pH 6.0)透析 12 小时。以12小时为间隔更换4次透析缓冲液后，通过12,000 g在4℃下离心30分钟使溶液澄清。在CM缓冲液中，以0.25至1.25 M的氯化钠线性梯度进行离子交换实验。洗脱下的样品使用HiLoad 26/60 Superdex 75 pg 柱 (Cytiva)和海水样溶液 (468 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 28 mM MgSO4, 25 mM MgCl2, 20 mM Na-HEPES pH 7.8) 作为运行缓冲液进行最后一步精细纯化。

产品信息

Reference
Raj I, Sadat Al Hosseini H, Dioguardi E, Nishimura K, Han L, Villa A, de Sanctis D, Jovine L. Structural Basis of Egg Coat-Sperm Recognition at Fertilization. Cell. 2017 Jun 15;169(7):1315-1326.e17.