作者：Xu-Mei Chen et al.
发表日期：2022年10月
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences

研究背景

S100蛋白是1965年从牛的大脑组织中分离出一种不含糖,脂,磷的神经系统特异性蛋白混合物,由于能够100%溶解在饱和硫酸铵的中性溶液中故得名S100蛋白。迄今,这类蛋白发现有共二十多个家族成员, S100A8(钙粒蛋白A)和S100A9(钙粒蛋白B)是钙结合蛋白S100家族的重要成员,大量存在于中性粒细胞胞质中的钙结合蛋白,常以S100A8/A9异二聚体形式存在。100A8和S100A9蛋白主要通过结合并活化Toll样受体和糖基化终产物受体从而介导细胞内的炎症信号传导等途径,在炎症中发挥重要的调节作用，参与多种慢性炎症性疾病的病理进程,在炎症反应和机体固有免疫过程中发挥重要作用。

实验方法

将目的基因插入修饰的pGEMEX-2的多个克隆位点，并做相应的密码子优化，以防止在蛋白质分离或储存过程中形成非特异性二硫键。在E. Coli BL21 (DE3) pLys 菌株中表达蛋白。将细胞重悬于裂解缓冲液 (30mM Tris-HCl pH 8.0, 含有 6M 盐酸胍，150mM NaCl, 1mM EDTA) 中。在冰上孵育 2 小时后，30,000 g 和 4℃ 下离心45分钟以除去未破碎的细胞和碎片。上清液分别含有未折叠的 S100A8 和 S100A9。将未折叠的 S100A8 和 S100A9 上清液以1:1 (v / v) 的比例合并，通过使用 6,000-8,000 MWCO 透析管在 4℃ 的温和搅拌下以缓冲液 (20mM HEPES-NaOH pH 7.0, 1mM EDTA) 透析降低盐酸胍浓度。1小时后，更换缓冲液并在 4℃ 下继续透析过夜。将重新折叠的 S100A8/A9 异二聚体在 4℃ 下以 IMAC 结合缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 7, 300mM NaCl) 透析。 使用 ÄKTA 纯化系统在室温下进行纯化，以 2 ml/min 的流速上样至 5 ml HisTrap FF crude column (Cytiva) 上。以 IMAC 缓冲液以及增加 10 mM 咪唑进行两次洗涤步骤，去除非特异性结合蛋白。用含有 250 mM 咪唑，2 ml/min 的流速，或 0 mM 至 400 mM 咪唑的 36 CV 线性梯度洗脱目的蛋白。将上一步洗脱的样品在 4℃ 下透析至 IEC 缓冲液 (20mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5mM EDTA) 中。 透析后，上样至 5 ml Source Q15 (Cytiva) 。以 0 M 至1 M NaCl 20CV 线性梯度洗脱 S100A8/A9。将上一步洗脱的样品浓缩并上样到 HiLoad 16/600 Superdex 75 PG (Cytiva) 上，以 30 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl 平衡柱子，并在同一缓冲液中以 0.8 ml / min 的流速洗脱目的蛋白。

产品信息

Reference
J.-L. Hau, H. Kremser, S. Knogl-Tritschler, V. Stefanski, J. Steuber, Gü. Fritz, Fast IMAC purification of non-tagged S100A8/A9 (calprotectin) from Homo sapiens and Sus scrofa, Protein Expression and Purification (2023), doi: https://doi.org/10.1016/j.pep.2023.106275.