作者：Wu et al.
发表日期：2016年11月
发表期刊：Cell
研究背景
在动物中，有机化合物中所含的能量可以通过线粒体氧化磷酸化 (OXPHOS) 系统释放产生ATP。数十年的广泛结构和功能研究描绘了这些大型质子泵复合体如何履行其职责的总体情况。尽管对CI, CIII和CIV进行了数十年的结构研究，但到目前为止只有SCs的低分辨率结构，这限制了对这些过程的机制理解。在本研究中，利用单粒子冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 和sub-region refinement方法，研究人员获得了近原子分辨率的哺乳动物SCI1III2IV1的结构，不仅揭示了CI, CIII和CIV的精确排列，而且还提出了电子从NADH转移到细胞色素C的可能机制。
实验方法
线粒体的分离在 4℃ 下进行。获得并尽快从屠宰场运送新鲜猪心到实验室。将 100 g 心肌切成小立方体，用 Milli-Q 水洗涤两次，悬浮在 100 mL 缓冲液A(100 mM Tris pH 7.4, 225 mM sorbitol, 60 mM KCl, 1 mM EGTA 和 0.1% BSA)中。将切碎的心脏组织在大容量搅拌机中均质化 300 秒。为了去除细胞碎片，将匀浆以 3,000×g 离心 10 分钟。收集上清液并施加于20,000×g 离心 30 分钟。将粗线粒体悬浮在 100 mL 缓冲液 B(100 mM Tris pH 7.4, 250 mM sucrose, 60 mM KCl, 40% Percoll和0.1 mM EGTA)中，并以 60,000×g 离心 50 分钟。小心吸出透明的线粒体条带并用缓冲液 C(100 mM Tris pH7.4, 100 mM sorbitol, 60 mM KCl, 0.05 mM EGTA)稀释。获得纯线粒体，将稀释的样品以 20,000×g 离心30分钟后。将纯线粒体悬浮在缓冲液 C 中，用 1% (w/v) digitonin 从线粒体内膜中提取呼吸超复合物过夜，并在 4 ℃ 下缓慢搅拌。以 150,000×g 超速离心 30 分钟。收集的上清液通过 100 kDa 离心过滤器 (Millipore) 浓缩至 1 mL。然后将 1 mL 样品上样，并使用 SW41 转子在缓冲液 D (25 mM Tris, pH 7.4, 60 mM KCl, 0.1% digitonin) 中以 0.6-1.8 M 蔗糖梯度在 150,000×g 下离心 20 小时。对梯度进行分级分离，并使用 3%-10% BN-PAGE 凝胶进行研究。最后，将纯化的呼吸链超复合物浓缩并在含有 10 mM Tris pH 7.4, 60 mM KCl 和 0.1% digitonin 的缓冲液中进行凝胶过滤色谱 (Superose6 increase 10/300 GL, Cytiva),收集样品用于电镜样品制样。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29091596 | Superose 6 increase 10/300 GL | 24 mL |
