作者：Xie et al.
发表日期：2023年3月
发表期刊：Science
研究背景
DNA依赖性RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerases, DdRP）的转录将遗传信息从DNA传递到RNA。虽然RNA聚合酶（Pols）I-III在大多数真核生物中是保守的，但植物具有两个额外的Pols IV和Pols V，参与植物特异性RNA介导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM）途径。在RdDM中，RNA依赖性RNA聚合酶2（RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2, RDR2）使用Pol IV转录本产生双链RNA，随后由DICER-LIKE 3（DCL3）加工成siRNA加载到ARGONAUTE 4（AGO4）中。在第二个下游步骤中，Pol V产生长非编码RNA（lncRNA）转录本，其作为结合AGO4-siRNA复合物的支架，然后招募DNA甲基转移酶DRM2（DOMAINS REARRANGED METHYLASE 2）以介导DNA甲基化和基因沉默。因此，Pol V具有双重作用，既产生转录本和将其他因子与染色质联系起来。尽管是从Pol II进化而来的，但Pol IV/V分支DdRPs各有其独特的功能。据报道，与Pol II相比，Pols IV和V都需要RNA引物，并且显示出较弱的体外转录活性。Pol IV也比Pol II更容易出错，而据报道Pol V具有更高的保真度。
实验方法
通过液氮冷冻和搅拌机将10Kg花菜组织均质化。将约16 L提取缓冲液（10 mM KCl，10 mM MgCl 2，1 mM DTT，5 mM EDTA，250 mM蔗糖，0.5%Triton-X-100，0.2 mM PMSF和10 mM HEPES，pH 7.8）加入到匀浆中，轻轻搅拌混合物。所得凝乳通过两层膜过滤。通过在4℃下以3,000 g离心20分钟收集花菜细胞核，并用提取缓冲液进一步洗涤两次。从10公斤花椰菜中可以获得约60克细胞核粗样。将约60g细胞核悬浮在60ml低盐缓冲液（20mM KCl，2mM MgCl 2，0.5mM DTT，0.2mM EDTA，25%甘油，0.2mM PMSF和20mM HEPES，pH 7.8）中破坏细胞核。然后加入90 ml高盐缓冲液（1.6 M KCl，2 mM MgCl 2，0.5 mM DTT，0.2 mM EDTA，25%甘油，0.2 mM PMSF和20 mM HEPES，pH 7.8）和2.5 kU SuperNuclease，轻轻摇动溶液10分钟以释放核酸。通过超声处理45分钟进一步除去核酸。将裂解物在4℃下以17,000g离心20分钟。 上清液用4层Miracloth（Millipore）过滤，并在RB400缓冲液（400mM NaCl，5mM MgCl 2，2mM DTT，10%甘油，0.1%NP40和50mM Tris-HCl，pH 7.5）下透析3小时，并用0.22μm过滤器（Millipore）过滤。将约2ml Protein G 填料加入到上一步的提取液中。孵育1小时后，通过低速离心去除填料，以除去非特异性结合蛋白。随后，将约200μg抗体5D2D8加入提取液中以捕获BoNRPE1。孵育3小时后，加入2ml新Protein G填料并进一步孵育1.5小时。Protein G填料以及结合的BoPol V通过低速离心收集。填料依次用200 ml Wash Buffer（400 mM NaCl、5 mM MgCl 2、2 mM DTT、5% 甘油、0.2% NP40 和 20 mM Tris-HCl，pH 7.5）和 100 ml Pre-Elution Buffer（400 mM NaCl、5 mM MgCl 2、2 mM DTT、1% 甘油、0.05% NP40 和 20 mM Tris-HCl，pH 7.5）清洗。BoPol V由5 ml终浓度为0.5 mg/ml 5D2D8表位肽（KKNPETELNAAAWG）洗脱。最后使用Superose 6 Increase 3.2/300 GL（Cytiva）和RB150缓冲液（150 mM KCl，5 mM MgCl2，2 mM DTT，1%甘油，0.05%NP40和20 mM HEPES，pH 7.8）在ÄKTA Pure Micro（Cytiva）设备上进一步纯化BoPol V。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29091596 | Superose6 increase 3.2/300 GL | 24 mL |
