作者：Wenjin Guo et al.
发表日期：2013年5月
发表期刊：Protein Expression and Purification
研究背景
利用痘苗病毒作为载体感染BSC40细胞进行HIV-1的gp120的外源表达，通过GNA亲和层析，DEAE离子交换层析，和凝胶过滤分子筛层析，对HIV不同毒株的重组gp120蛋白都能纯化制备出来，单体gp120的纯度超过93%，1L的培养体系可以获得约2 mg左右的单体gp120。层析纯化后的gp120蛋白通过Biacore SPR分子间相互作用检测能够与CD4和gp120的抗体IgG1 b12 均具有较强的相互作用力，证明重组的gp120蛋白经过层析纯化保持了天然构象，能够用于后续的药物筛选和其他药学实验。
实验方法
将gp120的基因序列构建到VV病毒基因组中（thymidine kinase gene locus），使用非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney cells，BSC40)作为宿主细胞，细胞培养之后进行Vaccinia virus (VV) 的感染，感染复数MOI为3，培养48h后经过离心去除细胞，取上清液，加入去垢剂Empigen BB至终浓度0.25%进行病毒破碎裂解。裂解液即可进行层析纯化。
首先用雪莲花凝集素GNA作为配基的亲和进行捕获，层析柱体积10 ml，先用结合液150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, 0.25% Empigen BB, pH 7.5平衡层析柱，样品进样后，用洗杂液500 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, 0.25% Empigen BB, pH 7.5进行杂质清楚，然后再用洗脱液150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, 0.25% Empigen BB, 1 M MMP, pH 7.5对gp120蛋白进行洗脱。
第二步用DEAE 离子交换层析进行流穿模式纯化，将上一步的样品经过透析至缓冲液100 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl, pH 8.0中，将5-ml DEAE层析柱用同样缓冲液平衡后，收集样品的通过柱子的流穿液。
最后一步利用Superdex 200 凝胶过滤层析精纯，选择HighLoad 26/600 Superdex 200层析柱，用缓冲液10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4平衡后，将浓缩的样品进行层析，收集gp120的单体和二体组分，后续进行鉴定和亲和力的测定。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 17098101 | CNBr activated Sepharose 4 FF | 10 g |
| 预装柱 | 28916540 | HiTrap Capto DEAE | 5×5 mL |
| 预装柱 | 28989336 | HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | 320 mL |
