作者：W. He, J. Zhang et al.
发表日期：2016年11月10日
发表期刊：Canadian Journal of Microbiology

研究背景

肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor， HGF) 是一类多功能生长因子，具有刺激血管增生 作用，通过局部肌肉注射携带 HGF 基因的质粒 DNA 可明显促进肢体急性缺血部位新生血管的形成，在 临床上具有治疗缺血性疾病的应用前景Zhang 等对质粒 pUDK-HGF 大规模纯化工艺 248 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2011 Vol.27 No.2 Journals.im.ac.cn 进行了大量研究，工艺成熟，能生产药用级重组质 粒 pUDK-HGF 注射液。其工艺是碱裂解后离心处理 获得澄清碱裂解液，直接用 Q-Sepharose XL 阴离子 交换层析捕获质粒 DNA；再用 Sephacryl S-1000 分 离除去 RNA；用 Source 15Q 对质粒 DNA 进行精 制。随着新填料 plasmidselect 的出现，生产超螺旋 质粒 DNA 的工艺随之更新，因此本文建立新的 pUDK-HGF 纯化工艺，该工艺为碱裂解细菌后，用 绸布滤去细胞碎片等絮凝物，获得碱裂解上清液； 上清液经 300 kDa 超滤柱进行浓缩，获得的浓缩液 经 Sephacryl S-1000 层析柱除去 RNA，然后通过 plasmidselect 层析柱对超螺旋质粒 DNA 进行捕获， 获得高纯度的超螺旋质粒 DNA，再通过琼脂糖凝胶 6BFF 对超螺旋质粒 DNA 进行脱盐；最终采用异丙 醇沉淀质粒 DNA，75％乙醇洗涤，配方溶液重溶获 得产品。

研究方法

变性包涵体通过0.45µm滤膜（Millipore，Billerica，USA）以去除聚集体。将滤液加载到5mL HisTrap FF柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE healthcare，Fairfield，USA）上，该柱用含有50mM咪唑的缓冲液A平衡。HisTrapFF的结合容量为每毫升包装200毫克。用平衡缓冲液洗涤未结合的蛋白质。用缓冲液a中的500mM咪唑以15CV/h的流速洗脱结合的蛋白质，然后根据在线紫外检测器（ZHD，志明生物，中国南京）测定的洗脱液吸光度收集结合的蛋白质。用30%饱和（NH4）2SO4沉淀含有靶蛋白的级分以除去咪唑。在3500g离心30分钟后，收集蛋白质沉淀并在缓冲液A中再溶解。然后将再溶解的蛋白质溶液加载到含有阳离子交换剂（5mL Hitrap CM FF，GE healthcare，Fairfield，USA）的色谱柱上，其结合容量为250mg/mL填料。加载和洗涤后，用含有0.1-1M NaCl线性梯度的缓冲液A以20CV/h的流速洗脱结合的蛋白质。

为了进一步提高目标蛋白的纯度，使用具有Ni Sepharose High Performance（GE healthcare，Fairfield，USA）的5mL HisTrap柱纯化重组蛋白疫苗。HisTrap HP的结合容量为每毫升包装200毫克。与HisTrap FF柱上的过程类似，用含有100-500mM咪唑的缓冲液A以15CV/h的流速洗脱与Draft结合的蛋白质。在变性条件下逐步纯化重组蛋白

产品信息

Reference
https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/77178/1/cjm-2016-0528.pdf