作者：Fuchs ACD, et al.
发表日期：2021年3月
发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

研究背景

序列特异性的蛋白质连接酶广泛应用于按需生产定制化蛋白。当需要短的连接结构域和好的化学选择性时，经常选择此类连接酶。但是在实验中，发现此类酶具备局限性，例如催化效率低，底物特异性差，存在副反应等。作者阐述了一个有更多优良特征的序列特异性蛋白连接酶Connectase。Connectase (Cnt)，是产甲烷古生菌内的20S蛋白酶体亚单位。实验表明Mtr A序列中一段高度保守的大约20个氨基酸残基组成的KDPGA结构域是与Cnt高亲和力互作所必要的。将等体积的裂解物与Cnt酶37℃孵育，并将HisTrap FF和 HiTrap Streptavidin HP层析柱串联，纯化出Cnt催化的Strep-Ub-(5)KDPGA(10)-His6和PGA(15)-Ub反应单一产物Strep-Ub-(5)KDPGA(15)-Ub，SDS-PAGE证明无副反应发生。因此Cnt连接反应是高特异性并且可应用于复杂的溶液体系中的，实验证明少量Cnt介导的大规模生产和一步纯化短时连接产物是可行的。可以将Mtr A 识别标签改为其他用途，连接两个不相关蛋白，用于新方法开发。

实验方法

重组表达PGA(15)-Ub及Strep-Ub-(5)KDPGA(10)-His6相关质粒，将质粒转化至E. coli，培养，诱导，离心收集细胞，20 mM Tris⋅HCl, 250 mM NaCl, pH 8.0重悬并利用弗式压碎机破碎，超速离心收集裂解液A，裂解液B。按照m（Cnt-His6纯品蛋白）/V（裂解液A+裂解液B）=0.09g/L的比例向等体积的裂解液A和裂解液B中添加Cnt-His6纯品蛋白，并于37℃孵育0-15分钟，将溶液pH调节至8.0，用于后续实验。

利用20 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0缓冲液平衡HisTrap FF和HiTrap Streptavidin HP层析柱。将酶连接后体系泵入到系统中进行上样，并利用20 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8.0缓冲液清洗掉层析柱上杂质。向系统中泵入2.5 mM 脱硫生物素，洗脱只含有Strep标签的蛋白。之后泵入2.5 mM 脱硫生物素, 250 mM咪唑缓冲液，洗脱同时含有His标签和Strep标签的蛋白。

利用SDS-PAGE检测各洗脱液中含有的组分，最终确定了2.5 mM 脱硫生物素洗脱液中只存在唯一的产物Strep-Ub-(5)KDPGA(15)-Ub，无其他Strep-Ub-(5)KD-X产物，证明了Cnt催化Mtr反应无其他副反应发生，因此Cnt连接反应是高特异性并且可应用于复杂的溶液体系中的，可用于后续方法开发。

产品信息

Reference
Fuchs ACD et al. Archaeal Connectase is a specific and efficient protein ligase related to proteasome β subunits. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Mar 16;118(11):e2017871118.