作者：Seagar M, et al.
发表日期：2017年7月
发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
研究背景
富含亮氨酸的胶质瘤失活1是神经元分泌的糖蛋白，参与形成带有Kv1通道的多蛋白复合物，研究发现早期成年期此蛋白会发生自然突变，引起伴发听觉功能的常染色体显性癫痫 。lgi1基因删除的动物模型展现出自发性癫痫发作。但是目前仍不确定LGI1缺乏引起癫痫发作的机制。作者利用HisTrap Excel 1 mL层析柱纯化出带有His标签的重组LGI1蛋白，LGI1活性实验及lgi1基因删除实验证明LGI1通过控制轴突Kv1通道的表达决定CA3锥体神经元的神经兴奋性，LGI1的缺乏会诱导Kv1通道稳固性降低，这在LGI1表达区的轴突处尤其明显，很可能导致癫痫发作。
实验方法
重组糖基化LGI1设计：信号肽SP（氨基酸位点1–21：蜂毒肽信号肽 ）、 His标签（氨基酸位点31–36：6个组氨酸组成的）, T7启动子标签（氨基酸位点47–59）,亮氨酸富集区（LRR）, epitempin结构域。按照设计，构建pFastBac-lgi1重组质粒杆状病毒表达系统，并转染到Sf9细胞中。离心，获取250 mL 培养基上清。添加0.5 M NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.02%Tween 20, 并添加NaOH调节培养基上清pH=7.4。10,000 × g, 25 ℃离心10 min, 0.02 µm滤膜过滤，收取上清。
首先，利用20 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween pH 7.4平衡1mL HisTrap Excel。以0.5 mL/min流速，向系统中泵入250 mL分泌液，并利用20 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween, pH 7.4清洗层析柱，共使用约80 mL清洗液。之后，利用20 mM NaHPO4, 0.5M NaCl, 20 mM咪唑洗去层析柱上杂质，最后用20 mM NaHPO4, 0.5M NaCl, 250 mM咪唑, pH 7.4溶液洗脱目的蛋白LGI1。
利用ÄKTA Purifier系统上UV检测器监测蛋白流出，并利用收集器分峰收集样品。SDS-PAGE分析目的蛋白所在组分及纯度，Bradford检测纯品蛋白浓度。最终确定纯化后蛋白纯度约为90%。WB显示纯化后蛋白可以和LGI1抗体及T7抗体反应，因此蛋白序列完整。为后续证明rLGI1蛋白能够修饰内在兴奋性奠定基础。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17371205 | HisTrap excel | 5×1 mL |
