作者：Yasin T, et al.
发表日期：2021年7月
发表期刊：Algal Research
研究背景
治疗性蛋白质的传统生物技术宿主，如细菌大肠杆菌和哺乳动物CHO细胞，长期以来一直被确立为主导平台，但最近的进展表明，微藻有可能成为替代平台。微藻是一类具有丰富多样性的群体，因其在新陈代谢上所表现出的极高可塑性而被广泛运用于如今的产品生产中，其中既包括了相对廉价的生物燃料和相关材料，也包括了越来越多高价值的生物产品，比如重组蛋白及治疗剂。而作为微藻类中的模式生物，莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）由于其拥有一套发达的分子工具来操纵基因表达，在近年来被用于生产许多的重组蛋白。在传统方法中，因为叶绿体的遗传学较为简单，且该细胞器可占细胞总体积的70%，所以利用叶绿体生产重组蛋白的方法在近年来更为成功。然而，叶绿体生产的重组蛋白存在一些无法忽视的缺陷，例如无法添加对蛋白的生物活性至关重要的翻译后修饰（比如糖基化），以及无法定向到其它亚细胞定位，从而阻碍了一些代谢工程的实现。而细胞核基因组中生产的重组蛋白则不存在以上的问题，从细胞核中表达的重组蛋白可以定位到细胞内的不同位置，包括内质网，从而接受如糖基化在内的一系列翻译后修饰。但随之而来的，是细胞核内复杂的基因表达调控以及转基因随机整合到核基因组的强烈倾向会显著阻碍核转基因重组蛋白地表达，进而导致了较低的重组蛋白滴度。
本文作者旨在通过控制单个细胞系的重组蛋白产量、培养基中的总生物量浓度以及重组蛋白在细胞内或培养基中的稳定性，来提高重组蛋白的滴度。在该方法中，本文作者选择了人源蛋白ICAM-1（Intercellular Adhesion Molecule 1）作为衣藻重组产生并分泌的目标产物。ICAM-1 为一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，由位于C端的一个小的胞内结构域、一个跨膜结构域以及位于N端的5个类Ig胞外结构域组成，具有胞外结构域上糖基化以及二硫桥导致多环的结构特征。重组的人类蛋白ICAM-1被定向分泌到细胞外培养基中，这些细胞生长在生物反应器中，采用补料批培养的策略以达到高细胞密度。最终，最大生物量滴度为40克/升，重组蛋白滴度为50毫克/升。藻类生产的ICAM-1蛋白显示出与哺乳动物细胞培养生产的ICAM-1相当的生物活性，这是用其原生配体LFA-1的结合试验测定的。这项工作表明，C.reinhardtii是利用喂养批量异养生长策略生产具有原生生物活性的高浓度复杂重组蛋白的可行选择。
实验方法
将从含有浓缩营养介质的生物反应器中获得的莱茵衣藻菌株培养在TAP（磷酸三乙酸酯）琼脂平板上，将TAP培养基装入锥形瓶中并置于轨道摇床上并施加持续光照，随后进行转化。将每次转化后的产物接种到含有15 μg/mL Zeocin 的TAP/琼脂板上，以选择阳性产物。所选产物在经过质粒构建与表达筛选后，使用生物反应器与培养基在优化后的实验条件下对其进行培养并每天进行取样，使用SDS-PAGE、Western blot、重组蛋白定量以及Coomassie染色来进行生物量、总蛋白和重组蛋白的分析，同时使用电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, IGP-MS）对样品进行分析。
将重组藻株放在装有TAP培养基的1L 锥形瓶中生长，并不断震荡和光照。生长九天后，将上清液从细胞中通过离心分离出来，对上清液进行真空过滤。澄清后的上清液通过阴离子交换层析纯化，利用ÄKTA pure 25和Hitrap Capto Q 5 ml 预装柱进行5个柱体积的结合缓冲液（Tris-HCl 50 mM, NaCl 0 M, pH 8.1）平衡，随后用洗脱缓冲液（Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, pH 8.1）进行洗脱。将洗脱后的样品稀释，使NaCl的浓度从250 mM降低至150 mM）。之后进行亲和层析，使用10个柱体积的结合缓冲液（Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4）对层析柱进行平衡和清洗，随后用3个柱体积的洗脱缓冲液（0.1 M 甘氨酸 at pH 3.5）进行洗脱。接下来，加入洗脱样品体积2%的1M Tris（pH 8.0）缓冲液平衡洗脱的样品。最后，样品缓冲液将在加入了PBS的浓缩管中离心并置换。
纯化后的蛋白质样品将使用Jurkat T细胞进行饱和结合实验。使用衣藻生产的ICAM-1 D2与哺乳动物生产的ICAM-1将会被Alexa Fluor 647标记，随后Jurkat T细胞在4 ◦C的条件下与稀释的蛋白质孵育15 min。然后进行流式细胞术，利用相对平均荧光强度，采用单位点非线性回归模型计算Kd值。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 11001303 | HiTrap Capto Q | 5×5 mL |
