作者：Harris T.A., et al.
发表日期：2019年06月
发表期刊：Cell Host Microbe
研究背景
脊椎动物宿主的皮肤微生物组，通过产生吸引或排斥蚊子的挥发物来影响蚊媒疾病的传播，从而影响它们寻找宿主的行为。蚊子是野生动物和人类之间的桥梁，将病原体的森林循环与人类和蚊子之间的循环联系起来。最近的研究表明，病原体也可以操纵哺乳动物宿主的皮肤微生物群，使其有利于自身的传播。如登革病毒（DENV-2）或寨卡病毒（ZIKV）感染可以提高皮肤共生细菌的水平，其中一些共生细菌产生苯乙酮，这是一种小分子挥发物质，可有效激活蚊虫的嗅觉神经系统，吸引更多蚊子寻找到受感染宿主，帮助蚊子在茫茫人海中进行定位，从而促进这些虫媒病毒的传播，去除共生微生物，则能大大降低对蚊虫的吸引。
科学家发现RELMα是一种富含半胱氨酸的小分泌蛋白，由表皮角质形成细胞和皮脂细胞表达，它表达需要膳食维生素A，并由治疗性维生素A类似物异维甲酸诱导，以RELMα依赖的方式保护皮肤感染。为了进一步研究其机理，建立动物模型，需对其进行外源重组表达和纯化。
实验方法
将鼠源的mRELMa和人类来源的hRETN基因进行密码子优化后，在大肠杆菌BL21体系中进行表达，使用ÄKTA层析系统进行纯化。
纯化具体方法如下：
- 细菌重悬于75 mL裂解缓冲液（20 mM Tris, pH 7.5, 1% Triton X-100和2 mM PMSF），并超声波裂解。离心，取微球重悬于40 mL包涵体缓冲液（100 mM Tris, pH 9.0, 7 M盐酸胍）中，加入 100 mM亚硫酸钠和20 mM四硫酸钠，在室温下搅拌过夜。
- 可溶性蛋白通过镍柱亲和层析进行初步纯化，先用平衡缓冲液（25mm Tris, pH 7.5，20 mM甘氨酸，6 M尿素）平衡柱子。加载样品并洗涤柱子，用含有250 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱结合蛋白。
- 将含有洗脱蛋白的收集组分混合，稀释至0.1 mg/mL，放入预冷的复性缓冲液（100 mM Tris, pH 8.5，20 mM甘氨酸，300 mM NaCl, 5 mM EDTA和2 M尿素)在4℃待溶液均匀后，加入终浓度5mM的半胱氨酸，混合至溶解，保持在4℃ 。在30 mM pH为4.5的醋酸钠缓冲液中透析（至少20:1 vol/vol），三次换液，每次透析8 - 14小时。
- 在超滤浓缩管中浓缩，并通过Superdex 75 分子筛进行体积排阻层析的精细纯化，将单体和聚集体分离。将含有单体蛋白的组分混合，浓缩。
- 为确认蛋白质的成分，从SDS-PAGE凝胶中切出了mRELMα和hRETN，用蛋白酶消化，通过液相色谱串联分析多肽和序列覆盖的质谱分析。mRELMα和hRETN的丰度分别为100%和99.9%。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17525501 | HisTrap FF | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 GL | 24 mL |
Reference
Harris T.A. Gattu S. Propheter D.C. Kuang Z. Bel S. Ruhn K.A. Chara A.L. Edwards M. Zhang C. Jo J.-H. et al. Resistin-like molecule alpha provides vitamin-A-dependent antimicrobial protection in the skin. Cell Host Microbe. 2019; 25 (e8): 777-788 DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.04.004
