作者：Wang J et al.
发表日期：2015年1月
发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
研究背景
多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）简称多抗，是异源抗原刺激机体产生免疫应答后，由浆细胞合成分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，是多种单克隆抗体的混杂物，故其可识别多个抗原表位。将外源抗原注射入能够产生免疫应答的动物体内后，就可以从该动物的血清中提取分离相应的多抗。其能结合不止一种抗原表位，对于表达量低的蛋白具有更好的灵敏性，能够放大低表达水平靶蛋白的信号。
相比于单克隆抗体开发，多抗制备过程相对简单，成本低廉且开发速度较快，被广泛应用于基础研究和诊断领域。在农业生产中，多抗常被用于农药残留的现场监测；在临床应用中，多抗可以用于病原物质检测、疾病的诊断，以及作为免疫抑制剂用于抑制移植后免疫排斥反应和自身免疫病的治疗。因此，开发出成熟的工艺，能够从抗血清中分离纯化出纯度高、非特异性背景低、应用性强的多克隆抗体是十分重要的。不同层析技术的组合应用，能帮助研究者高效的纯化出理想的多抗样品。
实验方法
- 金鱼血浆卵黄原蛋白Vtg的纯化
- 纯化兔血清中抗Vtg的IgG抗体
将金鱼（5mg/kg剂量）外源性注射过17β-雌二醇（E2）后的14天，进行尾静脉采血并收集血浆； 将1 mL的血浆上清样品加载至凝胶过滤层析柱Sephacryl S-300 HR 16/60，根据样品分子量大小将其进行初步的分离纯化，收集洗脱组分；
将P2峰样品上样至阴离子交换层析柱DEAE-Sepharose FF 12/20，根据不同分子表面所带电荷的不同通过阴离子交换层析进行分离。初始缓冲液条件为含 0.07 M NaCl 的25 mM Tris–HCl (pH 7.5) ，洗脱采用含0.07、0.1、 和0.2 M NaCl三种盐梯度的25 mM Tris–HCl (pH 7.5)缓冲液。随后收集洗脱组分；
将收集的P6峰通过native PAGE电泳染色后，显示其有约为 460 kDa 的单个条带，并在9%浓度的变性胶 SDS-PAGE 下显示三个主要条带，分别对应约 130、106 和 81 kDa三个 Vtg的组成多肽链的特征带，证明获得了纯度较好的Vtg蛋白。
将150 μg Vtg与弗氏完全佐剂混合后皮下注射免疫新西兰兔，并另外用100 μg Vtg与弗氏不完全佐剂混合，进行三次强化免疫，每两周一次。最后一次免疫结束后一周，收集血清；
选用亲和层析柱HiTrap Protein G，通过特异性吸附作用来纯化多克隆抗体中的IgG组分；
收集到的纯化后IgG通过高碘酸盐氧化法，将IgG用辣根过氧化物酶HRP共价标记，并用此建立了一种用于金鱼Vtg定量检测的夹心ELISA方法。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17116701 | HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR | 1 × 120 ml |
| 预装柱 | 28936541 | HiPrep DEAE FF 16/10 | 1 x 20 ml |
| 预装柱 | 17040501 | HiTrap Protein G HP | 1 x 5 ml |
