作者：Ting Zhang et al.
发表日期：2021年2月
发表期刊：Protein Expression and Purification

研究背景

在双抗合成工艺当中，经常会产生多种抗体片段杂质。单臂抗体片段（缺少一边Fab臂的抗体）是生产重组抗体的过程中的一种潜在的副产物，特别是在双抗生产当中，因为双抗的铰链区可能包含更加脆弱的工程化序列。由于这些杂质与双抗之间的结构差异较小，所以如何将这些杂质有效去除，一直是一个重要的课题。本研究中，研究者利用全新的Fibro PrismA亲和层析技术，实现了双抗与单臂片段杂质的有效分离，并与传统凝胶填料进行了比较。

MabSelect PrismA是由Cytiva推出的全新一代蛋白A亲和层析填料。与前代产品MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX相比，它拥有更高的结合载量，并增加了与VH3结构域相结合的能力。

由于单臂的副产物与双抗产物含有相同的Fc区域，所以使用MabSelect SuRe LX并不能将它们区分开，因为MabSelect SuRe LX只与抗体的Fc区域相结合。由于单臂副产物只有一个VH3结构域，而双抗有两个，并且PrismA配基具有与抗体VH3结构域相结合的能力，所以PrismA配基填料可能具有将两种分子区分的能力。Fibro PrismA是Cytiva全新推出的层析产品。与MabSelect PrismA相比，它采用纤维素作为基架，具有开放式孔道，可以实现高通量的流动，并能在极短的时间内达到高抗体结合载量，是可以分离两种分子的极佳选择。

实验方法

目标双抗分子由稳定转染的CHO-K1细胞表达，细胞收获液的滴度为2.9 g/L。将收获液分别使用MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA以及Fibro PrismA三种层析介质进行纯化（设备：ÄKTA pure 150，系统：Unicorn 7.0，层析柱：Tricorn 5/150）。对于MabSelect SuRe LX和MabSelect PrismA，均控制柱体积至大约3 mL，然后上样至40 mg/mL填料，以180 cm/h的流速进行上样，保留时间大约5分钟。对于Fibro PrismA，其体积大约0.4 mL，上样至30 mg/mL介质，流速设置为40个单元体积每分钟，保留时间1.5秒。平衡与上样结合阶段，采用50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4，洗脱阶段，使用线性pH洗脱至酸性（pH 3）。收集洗脱的样品后，分别进行CE-SDS与SDS-PAGE实验，分析各阶段的样品液成分。

结果表明，MabSelect SuRe LX不能明显区分几种小分子量的片段杂质，因为这几种杂质均含有相同的Fc片段；

MabSelect PrismA能够较好地区分开双抗与单臂杂质，因为它们的VH3链数量有区别，此外，一些之前的研究表明，向流动相中加盐可以提高分辨率，所以又向流动相当中加入了300 mM的NaCl，结果表明，盐确实提升了层析的分辨率，单臂杂质从29.7%降至15.9%；

对于Fibro PrismA，采用与MabSelect PrismA相同的条件进行实验，结果表明，Fibro PrismA确实能够提供更高的分辨率。通过对洗脱条件进行优化，改为pH步级洗脱，得到最终收率为80.2%。CE-SDS分析表明Fibro PrismA实现了稳定的单臂副产物去除能力。增加保留时间和洗脱液体积并不能将MabSelect PrismA的分辨率提高到这种水平，这可能与Fibro快速传质能力有关。

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Reference
Removing a single-arm species by Fibro PrismA in purifying an asymmetric IgG-like bispecific antibody - PubMed (nih.gov)