作者:Ting Zhang et al.
发表日期:2021年2月
发表期刊:Protein Expression and Purification
研究背景
在双抗合成工艺当中,经常会产生多种抗体片段杂质。单臂抗体片段(缺少一边Fab臂的抗体)是生产重组抗体的过程中的一种潜在的副产物,特别是在双抗生产当中,因为双抗的铰链区可能包含更加脆弱的工程化序列。由于这些杂质与双抗之间的结构差异较小,所以如何将这些杂质有效去除,一直是一个重要的课题。本研究中,研究者利用全新的Fibro PrismA亲和层析技术,实现了双抗与单臂片段杂质的有效分离,并与传统凝胶填料进行了比较。
MabSelect PrismA是由Cytiva推出的全新一代蛋白A亲和层析填料。与前代产品MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX相比,它拥有更高的结合载量,并增加了与VH3结构域相结合的能力。
由于单臂的副产物与双抗产物含有相同的Fc区域,所以使用MabSelect SuRe LX并不能将它们区分开,因为MabSelect SuRe LX只与抗体的Fc区域相结合。由于单臂副产物只有一个VH3结构域,而双抗有两个,并且PrismA配基具有与抗体VH3结构域相结合的能力,所以PrismA配基填料可能具有将两种分子区分的能力。Fibro PrismA是Cytiva全新推出的层析产品。与MabSelect PrismA相比,它采用纤维素作为基架,具有开放式孔道,可以实现高通量的流动,并能在极短的时间内达到高抗体结合载量,是可以分离两种分子的极佳选择。
实验方法
目标双抗分子由稳定转染的CHO-K1细胞表达,细胞收获液的滴度为2.9 g/L。将收获液分别使用MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA以及Fibro PrismA三种层析介质进行纯化(设备:ÄKTA pure 150,系统:Unicorn 7.0,层析柱:Tricorn 5/150)。对于MabSelect SuRe LX和MabSelect PrismA,均控制柱体积至大约3 mL,然后上样至40 mg/mL填料,以180 cm/h的流速进行上样,保留时间大约5分钟。对于Fibro PrismA,其体积大约0.4 mL,上样至30 mg/mL介质,流速设置为40个单元体积每分钟,保留时间1.5秒。平衡与上样结合阶段,采用50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4,洗脱阶段,使用线性pH洗脱至酸性(pH 3)。收集洗脱的样品后,分别进行CE-SDS与SDS-PAGE实验,分析各阶段的样品液成分。
结果表明,MabSelect SuRe LX不能明显区分几种小分子量的片段杂质,因为这几种杂质均含有相同的Fc片段;
MabSelect PrismA能够较好地区分开双抗与单臂杂质,因为它们的VH3链数量有区别,此外,一些之前的研究表明,向流动相中加盐可以提高分辨率,所以又向流动相当中加入了300 mM的NaCl,结果表明,盐确实提升了层析的分辨率,单臂杂质从29.7%降至15.9%;
对于Fibro PrismA,采用与MabSelect PrismA相同的条件进行实验,结果表明,Fibro PrismA确实能够提供更高的分辨率。通过对洗脱条件进行优化,改为pH步级洗脱,得到最终收率为80.2%。CE-SDS分析表明Fibro PrismA实现了稳定的单臂副产物去除能力。增加保留时间和洗脱液体积并不能将MabSelect PrismA的分辨率提高到这种水平,这可能与Fibro快速传质能力有关。
推荐产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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填料 | 17547401 | MabSelect SuRe LX | 25 mL |
填料 | 17549801 | MabSelect PrismA | 25 mL |
空柱 | 28406411 | Tricorn 5/150 | 5/150 |
预装柱 | 17549855 | HiTrap Fibro PrismA | 1 × 0.4 mL |